《Stress》：Repeated exposure to the smell of innate fear, trimethylthiazoline, promotes fear habituation and hippocampal cell proliferation in rats
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合成捕食者气味，如三甲基噻唑啉（Trimethylthiazoline, TMT），会引发啮齿类动物的先天恐惧反应，反映了进化上保守的防御机制。既往研究表明，反复暴露于先天恐惧刺激可诱导适应性过程，包括习惯化和去敏感化，这可能涉及杏仁核之外的额外神经回路，特别
合成捕食者气味，如三甲基噻唑啉（Trimethylthiazoline, TMT），会引发啮齿类动物的先天恐惧反应，反映了进化上保守的防御机制。既往研究表明，反复暴露于先天恐惧刺激可诱导适应性过程，包括习惯化和去敏感化，这可能涉及杏仁核之外的额外神经回路，特别是参与多种学习和记忆形式的大海马。为阐明由反复暴露于先天恐惧应激诱导的习惯化是否与海马的可塑性相关，本研究考察了反复暴露于TMT是否（i）减弱先天恐惧反应以及（ii）影响海马神经发生。二十只雄性Sprague-Dawley大鼠被随机分配至对照（蒸馏水）或TMT暴露组，持续14天。暴露期结束后评估焦虑和抑郁样行为。在暴露后2–3天收集血清样本，并分析脑组织中的神经发生和细胞分化。结果显示，反复TMT暴露促进了恐惧习惯化。有趣的是，即使将TMT暴露视为应激刺激，也未发现焦虑或抑郁样行为的显著变化。此外，反复暴露于TMT后海马细胞增殖增加，而不成熟神经元总数减少。与新神经元相比， adopting胶质细胞命运的细胞比例显著增加。当前结果支持捕食者气味应激促进海马增殖、抑制神经发生并改变胶质细胞命运选择的观点，揭示了反复TMT暴露和恐惧习惯化下的复杂结构重塑。
恐惧是动物对感知到的威胁或危险迅速产生的基本情绪，分为先天性和习得性两类。虽然习得性恐惧通过经验和联想学习产生，但先天性恐惧由捕食者、攻击性同类、疼痛或特定环境特征等特定刺激引发。从进化角度来看，动物检测和适当应对捕食者威胁的能力对生存至关重要，反捕食者防御行为在进化过程中得以保留。在先天性恐惧的触发因素中，嗅觉线索，特别是捕食者气味，是触发这些无条件防御行为的强效刺激。为在控制环境下研究该现象的生物学机制，先前的研究建立了使用三甲基噻唑啉（Trimethylthiazoline, TMT）的动物模型，这是一种最初从狐狸粪便中分离出来的化合物。尽管实验室大鼠和老鼠是在未接触捕食者的环境中饲养的，但TMT能可靠地引发啮齿类动物的无条件恐惧反应，表现为典型的僵直行为和其他防御反应。因此，TMT作为研究无学习恐惧神经通路的强大模型，独立于经验关联。
尽管对捕食者威胁的行为反应常被视为反射性的，但它们却是动态的。习惯化是一种适应性过程，定义为在反复暴露于相同刺激后行为反应的逐渐下降。对经典躯体应激原（如约束）的习惯化主要由下丘脑室旁核（Paraventricular Nucleus of the Hypothalamus, PVN）、外侧隔核（Lateral Septum, LS）和内侧前额叶皮层（Medial Prefrontal Cortex, mPFC）组成的回路介导。对于心理源性应激原，使用猫气味的研究表明，尽管这些气味引发强烈的先天防御行为，但大鼠在反复暴露后可能会对这些气味产生习惯化，这取决于逃脱方法的可获得性或环境的稳定性。这种从急性恐惧反应到习惯化的转变涉及神经处理的转换。虽然杏仁核在启动先天恐惧反应中起核心作用，但对重复恐惧诱导刺激的习惯化和去敏感化似乎涉及尚不确定的额外神经回路。
成年海马神经发生，即在齿状回（Dentate Gyrus, DG）内生成新神经元，在调节记忆和情绪行为中起重要作用。证据表明，涉及海马的联想学习任务可以使大鼠DG中成年生成神经元的数量加倍。相反，应激对海马突触可塑性、神经元形态和神经发生产生负面影响，从而损害学习和记忆。同样，TMT暴露会导致急性和慢性应激，已知这会抑制海马细胞生长和神经发生。然而，由于学习和习惯化通常与新生神经元的存活有关，习惯化学习触发的神经生成驱动是否成功克服了TMT诱导的应激的抑制作用仍不清楚。确定这种动态相互作用是否维持海马可塑性，对于理解进化上保守的恐惧反应的减弱至关重要。因此，本研究旨在探究反复暴露于TMT对动物模型中先天性恐惧习惯化的影响。本研究试图阐明持续的先天恐惧反应是否可以通过反复暴露于先天恐惧刺激来减弱。评估的行为包括对恐惧反应、抑郁样行为和焦虑样行为的反复TMT暴露。此外，将在细胞水平上检查反复暴露于TMT的潜在机制，重点关注神经发生。研究人员假设恐惧刺激的反复暴露有助于恐惧习惯化。此外，研究人员假设有效的习惯化与增强或持续的海马神经发生有关，后者作为对抗应激带来的行为绝望的缓冲剂。
在动物和伦理声明方面，所有动物实验程序均经过香港理工大学动物受试者伦理小组委员会审查和批准，并根据香港《动物（控制实验）条例》进行。方法报告符合动物研究体内实验报告（Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments, ARRIVE）指南。使用的动物来源为香港理工大学集中式动物设施（Centralized Animal Facility, CAF）购买的六至七周龄雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠。
主要技术方法包括：首先，构建TMT暴露系统，使大鼠能在非约束圆柱体内自由活动但不能逃避TMT暴露，每次暴露持续10分钟，连续14天，并在最后三天（第12-14天）腹腔注射溴脱氧尿苷（Bromodeoxyuridine, BrdU）以标记中枢神经系统中的增殖细胞。其次，进行行为学测试，包括记录僵直行为以评估恐惧反应，进行旷场实验（Open Field Test, OFT）以评估焦虑样行为，以及进行强迫游泳测试（Forced Swimming Test, FST）以评估抑郁样行为。最后，通过心脏灌流收集脑组织，进行免疫组织化学染色和免疫荧光双标，检测BrdU、双皮质素（Doublecortin, DCX）、离子结合adapter分子1（Ionized Calcium-Binding Adapter Molecule 1, IBA-1）和胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）阳性细胞，并通过Sholl分析评估不成熟神经元的树突复杂性。
研究结果如下：
3.1 反复暴露于TMT未改变组间体重，但揭示了组内不同的体重动态
在治疗第1、7和14天测量动物体重。统计分析显示，时间与TMT暴露存在显著的交互作用，表明TMT暴露对体重的影响依赖于时间段。第14天时，TMT组的平均体重显著低于对照组，但组间体重增加无显著差异。
3.2 反复暴露于TMT诱导了先天恐惧反应的习惯化，但未改变情绪相关行为
研究发现，TMT组在初始暴露时表现出强烈的急性恐惧反应，僵直时间显著长于对照组。随着暴露次数增加，组间僵直时间差异逐渐缩小，表明发生了习惯化。在OF和FST中，两组间在运动活性、中心区域停留时间及漂浮时间上均未发现统计学显著差异，尽管观察到边缘效应，表明在当前设置下，TMT暴露允许对先天恐惧产生习惯化，而不会带来显著的负面情绪后果。
3.3 反复暴露于TMT增加了海马细胞增殖，触发了促胶质细胞谱系转换和神经炎症反应
组织学数据显示，与对照组相比，TMT组海马中BrdU阳性细胞总数显著增加，表明细胞增殖增强。然而，代表不成熟神经元的DCX阳性细胞总数显著减少，且DCX/BrdU比率降低。相反，代表星形胶质细胞的GFAP/BrdU比率显著增加，表明神经前体细胞向星形胶质细胞谱系发生了偏移。此外，TMT组海马中IBA-1阳性小胶质细胞总数显著增加，提示微胶质细胞聚集增强，但IBA-1/BrdU比率无显著变化，表明微胶质细胞数量的增加可能反映的是现有细胞的激活或招募，而非增殖率改变。Sholl分析显示，组间不成熟神经元的树突复杂性无显著差异。
讨论部分总结了上述发现。尽管传统观点认为急性应激抑制海马神经发生，但本研究显示反复TMT暴露实际上增强了海马细胞增殖。然而，伴随整体增殖增加的是不成熟神经元总数及其分化率的下降，以及向星形胶质细胞分化率的增加。这表明在海马齿状回中，神经干细胞可能向替代谱系（如胶质细胞）转移。微胶质细胞数量的增加可能反映了应激诱导的激活或招募。研究者指出，这些生物学变化可能与行为习惯化平行发生，作为对重复应激的适应性反应，但不一定构成行为变化的根本原因。研究局限性包括仅使用雄性大鼠、样本量较小以及TMT暴露系统可能存在约束应激作为混杂因素。未来研究应包括两性别的比较，并测量血浆皮质酮等生物学变量。
结论部分指出，本研究为反复暴露于TMT诱导的先天恐惧习惯化的机制提供了新见解。行为结果强化了反复先天恐惧刺激暴露在减少僵直行为方面的有效性，且未加剧焦虑或抑郁样行为，为暴露疗法的安全性和可行性提供了临床前证据。在细胞层面，与急性应激模型通常显示的抑制作用相反，反复TMT暴露导致海马细胞增殖增加，但并未产生功能性的神经发生。相反，研究发现了一个显著的谱系转换，神经干细胞被重新定向至星形胶质细胞命运而非神经元成熟。这些结果强调了在反复TMT暴露和先天恐惧习惯化下，海马齿状回复杂的结构重塑，对“应激总是抑制海马细胞增殖”的传统观点提出了挑战。
