利用计算生物学、生物化学及体内实验方法，鉴定出源自锌数据库的抗锥虫候选化合物，这些化合物能够靶向锥虫（Trypanosoma congolense）的溶酶体α-甘露糖苷酶

《Experimental Parasitology》：Identification of ZINC Database-Derived Antitrypanosomal Candidates Targeting Trypanosoma congolense Lysosomal-α-Mannosidase Using Computational, Biochemical and In Vivo Methods

　　

阿卜杜勒蒂夫·萨尼·阿德巴约（Abdulateef Sani Adebayo）|巴希鲁·易卜拉欣（Bashiru Ibrahim）|阿里尤·丹塔尼·阿卜杜拉希（Aliyu Dantani Abdullahi）|穆贾希德·阿布巴卡尔（Mujaheed Abubakar）|艾哈迈德·法德鲁拉赫曼·艾哈迈德·希达亚特（Ahmad Fadhlurrahman Ahmad Hidayat）|萨哈鲁丁·本·穆罕默德（Saharuddin Bin Mohamad）|雅库布·K.E.易卜拉欣（Yakubu K.E. Ibrahim）|穆罕默德·奥瓦尔·易卜拉欣（Mohammed Auwal Ibrahim）

尼日利亚卡杜纳州扎里亚市艾哈迈杜·贝洛大学（Ahmadu Bello University）生物化学系

摘要

动物非洲锥虫病（African Trypanosomiasis，AAT）主要由刚果锥虫（Trypanosoma congolense）引起，持续威胁着撒哈拉以南非洲地区的牲畜生产力。该疾病的持续存在主要是由于变异表面糖蛋白（Variant Surface Glycoproteins，VSGs）的抗原变异，这些变异使得寄生虫能够逃避免疫系统。溶酶体α-D-甘露糖苷酶（Lysosomal α-D-mannosidase，LDM）在VSG的代谢过程中起着关键作用，抑制LDM可能会影响寄生虫的存活。本研究采用计算和生化方法对刚果锥虫的溶酶体α-D-甘露糖苷酶（TcLDM）进行了表征，并筛选出潜在的抑制剂化合物。首先构建并验证了一个高质量的TcLDM同源模型，随后利用ZINC数据库中已知的38种α-甘露糖苷酶抑制剂的结构类似物进行分子对接，最终筛选出4种对寄生虫具有良好选择性的抑制剂（ZINC000003795857、ZINC000043929526、ZINC000257502749、ZINC000257502751）。使用GROMACS 2022软件进行的分子动力学模拟（100纳秒）证实了这4种配体的结构稳定性，尤其是基富宁辛（kifunensine，ZINC000003795857）及其类似物ZINC000257502749，它们与关键催化残基之间存在持续相互作用。实验上，通过离子交换色谱和凝胶过滤技术分离并部分纯化了TcLDM，纯化倍数达到1.62，其分子量约为66 kDa，在pH 5.0时活性最高，K_M约为0.503 mM。基富宁辛表现出混合类型的抑制作用，IC₅₀为52.97 μM，显著降低了寄生虫的催化效率。体内实验表明，基富宁辛以剂量依赖的方式抑制了寄生虫血症，在高浓度下几乎能够清除寄生虫。这些发现共同表明TcLDM是一个可行的酶靶点，基富宁辛和ZINC000257502749是设计抗锥虫药物的有希望的候选分子。

引言

动物非洲锥虫病（African Trypanosomiasis，AAT），又称纳加纳病（Nagana），仍然是撒哈拉以南非洲地区牲畜生产力和农村经济增长的主要限制因素。该疾病主要由采采蝇（Glossina spp.）传播，给牲畜养殖户带来巨大经济损失。尼日利亚的最新模型估计，每年因该疾病造成的损失高达5.777亿美元，占牲畜GDP的近7%；预测显示，如果不采取有效措施，未来50年内相关损失可能上升到牲畜GDP的85%（Odeniran等人，2021年）。然而，适当的控制策略可以将损失降至1670万美元（Odeniran等人，2021年）。尽管在理解锥虫生物学方面取得了进展，但AAT的控制仍然依赖于化疗，但由于广泛存在的耐药性和对宿主的毒性，一线药物如丁胺嗪乙酸酯（diminazene aceturate）和异美米丁（isometamidium chloride）的效果受到了影响（Kamte等人，2017年）。这种持续的负担在埃塞俄比亚和尼日利亚等国家尤为严重，这些国家的疾病发病率最高（Okello等人，2022年）。在致病因子中，刚果锥虫（Trypanosoma congolense）通常被认为是反刍动物中的主要病原体，会导致严重的贫血和高发病率，并且已报告其对丁胺嗪和异美米丁产生了耐药性（Degneh等人，2019年；Leta等人，2016年；Okello等人，2022年）。

非洲锥虫感染的长期存在是由于寄生虫的变异表面糖蛋白（VSG）外壳所致，这种外壳是由GPI锚定的密集单层结构，它隐藏了不变的膜蛋白并允许抗原变异，从而导致周期性的寄生虫血症和持续的免疫逃避（Garrison等人，2021年）。此外，布鲁氏锥虫（Trypanosoma brucei）中的某些VSG变体通过限制药物内化来降低苏拉明（suramin）的吸收（Wiedemar等人，2018年），这将抗原变异与人类非洲锥虫病（HAT）中的药物敏感性降低联系起来。虽然苏拉明主要用于治疗HAT而非AAT，但这一观察结果强调了寄生虫表面变异如何影响药物吸收。尽管关于布鲁氏锥虫中VSG周转的许多知识来自体外研究，但在体内条件下的周转动态，特别是在活跃的免疫监视下，仍知之甚少。宿主免疫压力可能会改变VSG降解的途径或速率，可能促进其向溶酶体处理的转变。Nok和Nock（2002年）提供了有力的功能证据：他们用一种与转铁蛋白结合的吖啶醌处理刚果锥虫，使其完全清除，这归因于对溶酶体α-D-甘露糖苷酶的选择性抑制，这种酶是VSG糖链在蛋白水解前降解所必需的。实际上，溶酶体α-D-甘露糖苷酶（LDM）催化糖蛋白中α-1,2-、α-1,3-和α-1,6-连接的甘露糖残基的水解（Magez等人，2001年；Swanson等人，1992年）。在刚果锥虫中，这种酶在溶酶体糖蛋白的代谢中起核心作用，尤其是在内化VSG的降解过程中，从而维持膜稳态并支持免疫逃避（Nok等人，2000年；Nok & Nock，2002年）。抑制LDM会破坏糖蛋白的周转，导致溶酶体功能障碍和寄生虫死亡（Nok & Nock，2002年）。尽管锥虫物种间的α-甘露糖苷酶具有保守性，但比较分析显示它们在序列和结构上存在显著差异（Vandersall-Nairn等人，1998年），这可能解释了刚果锥虫对LDM抑制的敏感性高于布鲁氏锥虫（Nok & Nock，2002年）。鉴于其酸性的最适pH值和与哺乳动物同源物的有限同源性，刚果锥虫的溶酶体α-D-甘露糖苷酶（TcLDM）是一个机制上可行且具有选择性的抗锥虫药物设计靶点。

基于此背景，本研究旨在通过计算和生化方法结合使用来鉴定TcLDM的潜在抑制剂。这是首次将计算和实验方法结合起来对TcLDM进行表征，将酶动力学与药物发现过程联系起来。通过对ZINC数据库的基于结构的虚拟筛选，发现基富宁辛（kifunensine）及其结构类似物ZINC000257502749是有前景的TcLDM抑制剂。基富宁辛是一种已知的α-甘露糖苷酶抑制剂，但其对刚果锥虫中溶酶体α-D-甘露糖苷酶的抑制作用此前尚未被报道。因此，基富宁辛及其类似物可以为设计改进和更具选择性的TcLDM抑制剂提供有效的骨架，从而为对抗AAT提供急需的新化学实体。

章节片段

化合物库的构建

在之前针对α-甘露糖苷酶的研究基础上，选择了两种已知的抑制剂（基富宁辛和斯万森辛）作为参考骨架来指导化合物库的设计。这些分子被用作ZINC数据库中的查询结构，该数据库通过其集成的SmallWorld（图编辑距离相似性）和Arthor（基于SMARTS的子结构/模式匹配）搜索引擎进行相似性和子结构检索（Irwin等人，2020年）。简而言之，每个查询...

结果

图1展示了TcLDM的建模3D结构及其对应的Ramachandran图。该图显示，建模的TcLDM中有88.3%的残基位于最优选区域，主要对应于α-螺旋（φ ≈ –60°, ψ ≈ –45°）和β-折叠（φ ≈ –135°, ψ ≈ 135°）构象。仅有0.2%的残基位于不允许的区域，表明模型质量高，空间冲突少，立体化学几何结构令人满意。

讨论

迄今为止，基富宁辛的抑制作用主要针对α-甘露糖苷酶，尚无实验证据证明其具有抗锥虫作用。此外，从ZINC数据库系统地检索基富宁辛类似物并优先筛选针对TcLDM的抑制剂的工作此前尚未报道。重要的是，目前仍缺乏将计算筛选与实验方法相结合的综合性研究来验证TcLDM作为...

结论

本研究从ZINC数据库中鉴定出与刚果锥虫溶酶体α-甘露糖苷酶（TcLDM）结合的候选配体，并提供了初步的生化证据，支持该酶作为潜在药物靶点的相关性。TcLDM被表征为一种酸性溶酶体糖苷酶，这与其在寄生虫中参与糖蛋白降解的作用一致。对富含TcLDM的组分进行的动力学分析表明其具有可测量的底物亲和力和催化活性...

CRediT作者贡献声明

萨哈鲁丁·本·穆罕默德（Saharuddin Bin Mohamad）：撰写——原始草稿，可视化，软件，正式分析。穆贾希德·阿布巴卡尔（Mujaheed Abubakar）：撰写——原始草稿，资源，方法学，正式分析。艾哈迈德·法德鲁拉赫曼·艾哈迈德·希达亚特（Ahmad Fadhlurrahman Ahmad Hidayat）：可视化，软件，正式分析。巴希鲁·易卜拉欣（Bashiru Ibrahim）：方法学，研究，正式分析。阿里尤·丹塔尼·阿卜杜拉希（Aliyu Dantani Abdullahi）：撰写——原始草稿，研究，正式分析。阿卜杜勒蒂夫·萨尼·阿德巴约（Abdulateef Sani Adebayo）：撰写——原始草稿，方法学，研究，正式分析。

作者声明没有利益冲突。

资助

MAI获得了尼日利亚TetFund（NRF2020/SETI/43）的国家研究基金资助。

作者声明在本研究中不存在利益冲突

艾哈迈杜·贝洛大学的非洲被忽视热带疾病和法医生物技术卓越中心（ACENTDFB）提供的财政支持，该支持用于抵消工作所需的大部分费用。