评估DNA条形码技术在鲨鱼识别中的有效性

《Forensic Science International》：Assessing the Effectiveness of DNA Barcoding in Shark Identification

　　

肖伟恒|戴雅迪|楚旭峰|刘西玲

中国昆明医科大学法医学学院法医遗传学系，昆明650500

摘要

鲨鱼种群的保护状况日益令人担忧，许多物种面临灭绝的风险，这主要是由于鲨鱼鳍贸易所致。有效保护和监管非法鲨鱼鳍贸易需要从样本中准确鉴定鲨鱼物种。然而，传统的DNA条形码技术在应用过程中存在一定的局限性。为了解决这些问题，本研究系统分析了鲨鱼细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因序列，重点研究了鲨鱼种群之间的遗传距离分布以及物种层面的DNA条形码间隙。研究结果表明，现有的公共鲨鱼COI数据集存在不准确之处，包括条形码标记错误和物种鉴定错误。为此，我们建立了一个经过整理的高质量鲨鱼物种鉴定参考数据库。遗传差异分析显示，不同鲨鱼之间的种内和种间距离存在显著差异，351个物种中有149个物种显示出明显的条形码间隙。此外，不同物种的鉴定阈值也存在差异。我们还评估了12对COI引物对，其中Inoue等人开发的引物在降解样本上的表现更为优异。将COI条形码技术应用于258个鲨鱼鳍样本后，成功鉴定出了大部分样本，但无法区分四个亲缘关系密切的物种。相比之下，16S rRNA标记提高了鉴定精度，而COI鉴定错误归因于数据库中的错误。值得注意的是，数据仍存在严重不平衡现象：56个鲨鱼物种仅由一个COI序列代表，208个物种缺乏可靠的参考条形码。本研究不仅整理并建立了一个全面的鲨鱼物种鉴定DNA条形码库，还评估了各种引物的有效性，为标准化物种鉴定程序提供了有价值的框架。

引言

鲨鱼属于软骨鱼亚门（Chondrichthyes）板鳃亚纲（Elasmobranchii）下的两个单系谱系之一[1]。板鳃亚纲包括八个目：真鲨目（Carcharhiniformes）、鼠鲨目（Lamniformes）、猫鲨目（Orectolobiformes）、锯鲨目（Pristiophoriformes）、六鳃鲨目（Hexanchiformes）、异齿鲨目（Heterodontiformes）、鼠鲨目（Squaliformes）和平鲨目（Squatiniformes），共包含约37个科和536个物种，广泛分布于全球海洋生态系统中[1]。在全球范围内，鲨鱼既作为目标物种被捕捞，也作为非选择性渔业的副渔获物被捕获[2]。这种捕捞行为部分是由于消费者对鲨鱼制品（尤其是鲨鱼肉和鱼鳍）的大量需求[3]、[4]所驱动的。近几十年来，包括鲨鱼在内的软骨鱼类种群由于人为压力和气候变化等多种因素而迅速减少[5]、[6]、[7]。值得注意的是，目前有超过三分之一的板鳃亚纲物种面临灭绝威胁[8]。根据国际自然保护联盟（IUCN）红色名录的数据，超过17%的鲨鱼物种被列为濒危物种或面临更高的灭绝风险。鲨鱼具有生长缓慢、性成熟延迟、繁殖力低和寿命长的生活史特征，这些因素共同阻碍了它们在人为影响后的种群恢复[9]、[10]、[11]。尽管存在这些脆弱性，鲨鱼作为重要的中型捕食者和顶级捕食者，在维持海洋生态系统稳定方面发挥着关键作用[5]、[12]、[13]。因此，保护鲨鱼至关重要。为此，各国政府和国际组织实施了各种监管措施，其中最著名的是《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES，2023年）。根据CITES附录II的规定，许多鲨鱼分类单元被列为家族、属和物种级别，以规范贸易。

鲨鱼保护的一个基本组成部分是准确客观地鉴定与鲨鱼相关的生物样本。这种鉴定主要采用两种方法：形态学分析和分子生物学技术[14]、[15]。然而，来自非法捕鱼活动的样本往往以碎片化形式出现，例如孤立的鲨鱼鳍[16]。鲨鱼鳍在某些文化背景下被视为高价值食品[3]。鱼鳍的高市场价值与鲨鱼肉相对较低的价值之间的显著经济差异，促使了“割鳍”行为的出现，即割下鱼鳍后将尸体丢弃在海中[17]、[18]。这种状况使得形态学物种鉴定变得复杂，因此分子生物学方法成为鲨鱼鳍产品物种鉴定的主要手段[4]、[19]、[20]。分子系统发育鉴定，特别是DNA条形码技术，相比形态学方法具有明显优势，后者需要相对完整的样本和较高的分类学专业知识。自DNA条形码技术问世以来，由于其操作简便性和高鉴定准确性而迅速得到广泛应用[21]、[22]。

在过去几十年中，DNA条形码技术自开发以来逐渐成熟[23]、[24]、[25]、[26]、[27]。该技术基于DNA条形码间隙的概念，利用物种内部和之间的遗传差异进行鉴定。该方法通过将获得的DNA序列与参考数据库进行比较，根据遗传差异将未鉴定的样本分配到已建立的分类类别中[14]、[28]。在动物物种鉴定中，线粒体细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因被广泛用作标准DNA条形码标记。Camiel等人报告称，完整的COI基因长约1,535个碱基对，可分为COI-5p和COI-3p等区域。Hebert等人提出的COI-5p片段已被广泛用作主要条形码片段。此外，COI-3p和COI-FF等其他区域也被用于某些分类学研究。除了COI基因外，还有其他线粒体基因和核基因被用于鲨鱼的分子物种鉴定[1]、[29]、[30]。尽管DNA条形码技术具有优势，但在实际应用中也存在局限性。首先，不同分类单元的DNA条形码进化速率不同，对不同群体应用统一的序列差异阈值可能导致错误的物种鉴定[31]、[32]、[33]、[34]。其次，DNA条形码依赖于与参考序列的比较分析，这要求数据库中的物种注释具有高准确性。然而，现有研究在常用数据库（如Barcode of Life Data System (BOLD) 和 National Center for Biotechnology Information (NCBI)）中发现了分类错误，可能影响分类推断的可靠性[8]、[35]。

为了解决这些挑战，本研究开发了一套系统的物种鉴定工作流程。首先，从公共数据库中收集与目标物种相关的DNA条形码数据，并对其进行严格的质量控制，排除可能存在条形码标记或分类错误的信息。利用整理后的数据集，在种内和种间、属、科以及目等分类水平上进行了全面的遗传距离和序列相似性分析。这种方法使得能够系统地评估鲨鱼物种鉴定的阈值和参考数据库，从而为物种鉴定提供了可靠和全面的框架。此外，应用该工作流程，使用COI基因序列对258个鲨鱼鳍样本进行了物种鉴定，为标准化物种鉴定程序提供了科学参考。

章节片段

遵守伦理标准

本研究获得了中华人民共和国司法部法医学科学院伦理委员会的批准（批准编号：2024-36）。

COI基因序列的收集与整理

在对八个鲨鱼目进行筛选后，从BOLD数据库中检索到了13,710条带有COI标签的鲨鱼DNA条形码序列。这些序列用于建立鲨鱼物种鉴定参考数据库，并基于这些序列进行鲨鱼种群间的遗传距离分析。

参考数据库和序列分析

在本研究中，我们收集了代表352个鲨鱼物种的13,710条COI基因序列，以创建鲨鱼物种鉴定参考数据库。该数据集包括8,551条来自真鲨目的序列、38条来自异齿鲨目的序列、135条来自六鳃鲨目的序列、1,299条来自鼠鲨目的序列、46条来自锯鲨目的序列、2,745条来自鼠鲨目的序列以及355条来自平鲨目的序列。在去除重复条目并应用质量控制后...

讨论

在本研究中，我们汇总了来自BOLD数据库的所有公开可访问的鲨鱼COI序列，这些序列整合了ELASMOMED和FISH-BOL等项目的资料。经过严格的筛选流程，我们建立了一个包含5,090条经过验证的鲨鱼DNA条形码参考数据集。此外，本研究从多个角度评估了DNA条形码技术在鲨鱼物种鉴定中的有效性，如遗传距离指标、条形码长度等...

结论

本研究通过开发全面的参考数据库、选择最优的DNA条形码和引物以及建立物种分配方法，对鲨鱼物种鉴定进行了系统研究。通过排除具有错误物种注释、不准确条形码信息和低质量序列的数据，我们整理出了一个包含5,090条序列的鲨鱼参考数据库。在评估的12对COI引物中，有4对的扩增成功率超过了90%。

CRediT作者贡献声明

肖伟恒：撰写——原始草稿、方法学设计、实验研究、数据分析、数据整理。戴雅迪：实验研究、数据整理。楚旭峰：数据分析。刘西玲：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。