《IBRO Neuroscience Reports》：Establishment of a Novel Rat Model of Chronic Subdural Hematoma: Recapitulating Human Pathological Features Through Triple-Component Induction
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目的：本研究旨在开发一种新型慢性硬膜下血肿（Chronic Subdural Hematoma, CSDH）大鼠模型，该模型能更好地重现人类病理生理机制，从而提高转化研究的临床相关性。材料与方法：CSDH模型采用三组分系统建立，该系统包含同种异体静脉血、脑脊液
目的：本研究旨在开发一种新型慢性硬膜下血肿（Chronic Subdural Hematoma, CSDH）大鼠模型，该模型能更好地重现人类病理生理机制，从而提高转化研究的临床相关性。材料与方法：CSDH模型采用三组分系统建立，该系统包含同种异体静脉血、脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）和脑微血管内皮细胞（bEnd.3）。立体定向手术包括通过微量注射泵将混合物（200 μL）注入硬膜下腔，随后以72小时间隔进行两次额外注射。随后对模型进行系统验证。数据使用GraphPad Prism 9进行分析。所有程序均遵循ARRIVE指南并获得伦理批准。结果：CSF-血液共培养系统产生了机械稳定、异型重塑的血凝块，其超微结构特征与人类CSDH膜相似。优化的CSDH模型在MRI上表现为新月形硬膜下血肿，血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）/血管生成素-2（Angiopoietin-2, Ang-2）/基质金属蛋白酶-9（Matrix Metalloproteinase-9, MMP-9）表达峰值在时间上一致（第14天），且神经功能逐渐恢复，紧密重现了临床病理进展。结论：本研究建立了一个可重复的CSDH模型，结合渐进性硬膜下注射和立体定向定位，以重现慢性血肿动力学，并通过定量形态学、炎症和功能分析进行验证，从而为机制和治疗研究提供了一个临床可靠的平台。
慢性硬膜下血肿（Chronic Subdural Hematoma, CSDH）是神经外科常见疾病，年发病率在老年人群中高达1.72–20.6/10万，且因全球人口老龄化和抗凝/抗血小板药物广泛使用而持续上升。其病理生理学模型认为，CSDH通过硬脑膜边缘层内出血、过度增殖、血管脆性增加及再出血的自我维持循环而发展。2017年，Edlmann等人阐明了炎症级联反应和血管生成失调在CSDH发病中的核心作用。然而，临床管理指南尚未统一，钻孔引流术后复发率达10%–20%，而脑膜中动脉栓塞（Middle Meningeal Artery Embolization, MMAE）虽复发率较低，但仍需进一步验证。现有临床前动物模型存在显著局限：大动物模型（如非人灵长类、犬）成本高且可重复性差；小鼠模型（大鼠/小鼠）虽具有操作简便、成本低等优势，但早期模型受限于手术粗糙、死亡率高，且单次注射无法复制人类CSDH的慢性血肿扩大动态。因此，研究人员旨在开发一种能更好重现人类病理生理机制的新型大鼠CSDH模型，以提升转化研究的临床相关性。
该研究由Qiuyu Lu、Renkun Zhang、Yuhao Tan、Yi Xu、Yongwei Zhang、Rui Zhao、Qiang Li、Pengfei Yang、Jianmin Liu及Qiao Zuo共同完成，论文发表在《IBRO Neuroscience Reports》。研究人员通过三组分诱导系统，结合立体定向多次注射，成功建立了大鼠CSDH模型，并进行了系统验证。研究结论表明，该模型在形态学、分子表达和功能评估方面均紧密模拟人类CSDH的慢性进展，为机制和治疗研究提供了可靠的临床前平台。
在技术方法方面，研究人员使用了SPF级雌性Wistar大鼠（12月龄，500–600 g，来自浙江维通利华实验动物技术有限公司）和bEnd.3细胞（购自美国模式培养物保藏中心，ATCC，CRL-2299）。主要方法包括：通过立体定向框架在颅骨钻孔（坐标：前囟后4 mm、外侧5 mm），使用玻璃微管结合微量注射泵向硬膜下腔注射200 μL三组分混合物（同种异体静脉血150 μL、含1×10?个bEnd.3细胞的脑脊液50 μL），注射速度20 μL/min，留置针头10 min防反流；随后以72小时间隔进行两次相同注射。模型验证涵盖大体病理观察、苏木精-伊红（HE）染色、9.4 T磁共振成像（MRI）、蛋白免疫印迹（Western blot）检测血管生成相关因子及神经功能测试（改良神经功能缺损评分，modified Neurological Severity Score, mNSS；足失误测试，Foot-fault test）；数据分析使用GraphPad Prism 9。
研究结果保留以下小标题并简要说明结论：
**3.1 大鼠CSF采集**：研究人员采用立体定向装置经枕大池穿刺采集脑脊液（CSF），成功率100%，无死亡率，单次采集体积达150 μL。
**3.2 体外血液-CSF相互作用实验**：实验组（CSF-血液混合物）形成自支撑的血凝块样结构，机械扰动（振荡或刀切）后仍保持形态完整，说明存在机械稳定的包膜。扫描电镜显示包膜由多孔基质组成，主要成分为高度交联的胶原纤维网络；透射电镜进一步识别到红细胞衍生的变形体和脂样囊泡嵌入基质中。
**3.3 bEnd.3细胞表型验证**：培养24 h后细胞呈铺路石样形态，72 h达亚汇合状态。在低生长因子Matrigel系统中形成稳定血管管状结构，证实其血管生成潜能。免疫荧光双重标记显示CD31和血管性血友病因子（von Willebrand Factor, VWF）100%共表达，符合典型内皮细胞表型。
**3.4 CSDH动物模型的系统验证**
**3.4.1 大体病理和组织病理学评估**：术后24 h开颅可见同侧半球表面扇形分布硬膜下血肿，对侧硬脑膜完整。固定后冠状切片显示边界清晰的硬膜下血肿。HE染色确认血肿位于硬膜下腔，无脑实质侵犯、皮质挫伤或显著水肿。
**3.4.2 神经影像和血肿定量**：术后24 h MRI证实血肿位于颅骨与脑皮层之间，呈新月形、信号不均（以中度高信号为主）。纵向MRI显示血肿逐渐吸收，但第21天仍有残留，完全吸收需3周以上。
**3.4.3 分子和功能评估**：Western blot分析血肿包膜中血管生成相关蛋白（VEGF、Ang-2和MMP-9）在术后7、14、21天的变化：与假手术组相比，CSDH组蛋白水平呈时间依赖性升高，第14天达峰值，第21天下降，与MRI观察到的血肿吸收趋势一致。mNSS评分显示CSDH组在所有时间点均显著高于假手术组（p<0.05），且随时间逐渐改善。足失误测试表明CSDH组存在持续性运动缺陷，但随时间逐渐恢复。
在讨论部分，研究人员总结了现有CSDH动物模型的局限性：大动物模型（如非人灵长类、犬）成本高、技术复杂且可重复性差；小鼠模型虽具优势，但早期方法学限制（如手术粗糙、死亡率高）及单次注射无法复制慢性血肿扩大动态，导致病理生理学保真度不足。Quan等人（2015）通过两次自体血注射实现血肿持续超过3周，并验证了血管生成和炎症级联的关键作用；Xu等人（2021）使用Matrigel-bEnd.3细胞混合物建立模型，展示了进行性出血特征。然而，这些模型仍存在注射定位不准（导管直径大致血漏）以及血肿成分单一（缺乏血液成分）等问题。Sa??ro?lu等人（2024）采用两次自体血注射模型测试贝伐珠单抗（抗VEGF抗体）疗效，证实其有效且耐受良好；与该方法相比，本模型的三组分系统（全血、CSF、内皮细胞）更接近人类血肿液的多组分特性。本模型的创新在于：采用玻璃微管注射技术，结合7天建模方案，实现精确、渐进的血肿扩大；系统验证显示血肿呈新月形、持续超过3周，且促血管生成因子表达上调，符合人类CSDH关键特征。同时，研究人员指出模型局限性：21天观察期不足以完全模拟人类CSDH的数月慢性阶段，未来需延长至8周以上；CSF介导血肿扩大的分子机制尚未阐明，需整合蛋白质组学分析；此外，使用鼠源性bEnd.3细胞在大鼠模型中可能存在种属差异，但目前缺乏商品化的大鼠脑内皮细胞系。
最后，翻译研究结论部分：本研究建立的CSDH模型采用渐进性注射方案来复制硬膜下血肿的慢性扩大动力学，并结合立体定向引导的硬膜下定位方法以确保解剖精度。研究人员开发了一套定量评估框架，用于评估血肿进展、炎症反应和功能缺陷。模型的形态学、组织学和行为学特征与人类CSDH的临床观察一致，包括血肿结构、炎症细胞浸润和感觉运动障碍。该方法为探究CSDH病理生理学和筛选潜在治疗方案提供了一个可重复的平台。
