亮氨酸氨肽酶可激活型光敏剂实现神经母细胞瘤中的酶响应性光动力治疗

《ACS Omega》：Leucine Aminopeptidase-Activatable Photosensitizer Enables Enzyme-Responsive Photodynamic Therapy in Neuroblastoma

　　

光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）是一种微创且具有肿瘤选择性的治疗方式；然而，尽管其在若干癌种中已取得显著进展，针对脑肿瘤的有效治疗方案仍然有限。尽管仅有少量研究对此进行探索，携带可激活基团的光敏剂由于具有内在选择性，使PDT成为脑部肿瘤治疗的一种有吸引力策略。该研究首次报道了亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP）可激活的碘代间苯并吩噁嗪衍生物（LAP-RI）在神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）中的光动力学效能。通过引入LAP响应性连接基团，光敏剂在酶促激活前保持静默状态，从而利用本研究中观察到的SH-SY5Y细胞内升高的LAP表达。该可激活设计使神经母细胞瘤细胞相较于健康成纤维细胞表现出可测量但幅度较温和的光毒性增强（约2倍），这一现象反映的是酶依赖性激活，而非强内在肿瘤选择性。这种差异并不构成强烈的细胞系内在选择性证据，而是体现了与SH-SY5Y细胞中升高LAP活性相一致的酶依赖性激活。上述发现凸显了基于间苯并吩噁嗪（resorufin）的酶可激活型光敏剂作为PDT机制选择性平台在颅外肿瘤治疗中的潜力，并强调了可激活型PDT试剂更广泛的应用前景。

该文发表于《ACS Omega》。研究聚焦于神经母细胞瘤（neuroblastoma，NB）这一儿童常见高侵袭性颅外实体肿瘤的精准治疗问题。现有高危神经母细胞瘤治疗通常依赖强化疗、手术、放疗、自体干细胞移植、分化治疗及免疫治疗等多模式联合方案，虽然部分患者5年生存率有所提高，但复发、耐药及远期毒性仍然突出，临床上迫切需要兼具肿瘤特异性与低正常组织损伤的新策略。与此同时，光动力治疗（photodynamic therapy，PDT）因具备微创、时空可控和副作用相对较低等优势而受到广泛关注，但传统光敏剂往往缺乏足够的肿瘤特异性，限制了其精准应用。基于此，研究人员提出利用肿瘤相关酶触发的“可激活型光敏剂”提升PDT的分子选择性，将光敏剂活化与肿瘤细胞中异常酶活事件相耦联，以减少健康细胞中的非特异性光毒作用。

本文将亮氨酸氨肽酶（leucine aminopeptidase，LAP）作为触发靶点。LAP是一类可催化蛋白质和多肽N端亮氨酸残基水解的蛋白水解酶，其在多种恶性肿瘤中异常高表达，并与肿瘤细胞增殖、侵袭、血管生成及耐药等过程有关。研究人员注意到，尽管LAP可激活型光敏剂已在其他癌种中展现出良好效果，但在神经母细胞瘤中的应用仍几乎空白。因此，本研究以碘代间苯并吩噁嗪（iodinated resorufin，RI）为光敏核心，构建了亮氨酸封闭的LAP响应型光敏剂LAP-RI，验证其在神经母细胞瘤模型中的酶依赖性光动力激活效应。研究得出的核心结论是：LAP-RI在未光照时几乎无暗毒性，在LED照射后可对SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞产生高于L929健康成纤维细胞的光毒效应；这一差异与SH-SY5Y细胞较高的LAP3表达相一致，体现出酶依赖性激活机制。虽然该差异约为2倍，尚不足以说明强肿瘤内在选择性，但已构成神经母细胞瘤中LAP可激活PDT的首次证据。该工作的重要意义在于，它建立了单一酶触发、最简响应系统中“酶表达梯度—光动力效应”之间的定量关联，为未来开发更高选择性的酶响应型PDT平台奠定了机制基础。

从方法学上看，研究人员首先通过5步有机合成获得目标分子LAP-RI，并经反相高效液相色谱（high-performance liquid chromatography，HPLC）纯化至95%以上，结合¹H核磁共振、¹³C核磁共振和高分辨质谱（high-resolution mass spectrometry，HRMS）完成结构表征。随后在磷酸盐缓冲液中考察其在LAP存在下的紫外-可见吸收响应，评估酶促脱保护后释放RI的过程。体外实验采用SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞与L929健康成纤维细胞为比较模型，通过MTT法检测暗毒性与光毒性，通过共聚焦显微镜观察细胞内激活，通过实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR）检测LAP3基因表达，并结合活性氧（reactive oxygen species，ROS）清除剂实验、2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（DCFH₂-DA）探针检测以及吖啶橙/溴化乙锭（AO/EtBr）双染分析其作用机制与细胞死亡方式。

在研究结果部分，论文首先通过“合成与光谱激活特性”相关内容说明，LAP-RI被成功合成，总收率为14.5%。由于被封闭状态下电子离域受阻，LAP-RI显示位于410和490 nm的两个吸收峰；在LAP酶存在时，原有吸收带逐渐减弱，同时出现RI特征性的580 nm吸收峰，并且该变化随酶浓度增加而增强，表明LAP可有效介导LAP-RI向活性光敏剂RI转化。时间依赖实验进一步证明，在0.3单位LAP存在下，RI可随孵育时间延长持续释放。这一部分结果表明，该分子设计具备明确的酶响应激活基础。

在“细胞暗毒性与光毒性评价”部分，研究人员在SH-SY5Y与L929两种细胞中比较LAP-RI的体外效应。结果显示，细胞在黑暗条件下暴露24 h后，即便浓度增加至10 μM，也未出现显著细胞活力下降，说明LAP-RI暗毒性很低。相反，在595 nm LED照射后，LAP-RI在两种细胞中均引发时间和浓度依赖性的光毒作用，但SH-SY5Y细胞明显更敏感。尤其在预孵育1 h后，2.5 μM LAP-RI即可在SH-SY5Y细胞中造成显著活力下降，而L929细胞在相同条件下尚无显著毒性。定量分析表明，1 h预孵育条件下SH-SY5Y细胞的半数抑制浓度（IC₅₀）为3.42 ± 0.14 μM，而L929细胞为7.16 ± 0.21 μM，约2倍差异提示其对神经母细胞瘤细胞具有温和但可重复的增强光毒效应。作者强调，这一差异应解读为酶依赖性激活的结果，而非强烈内在肿瘤选择性的证明。

在“细胞内激活与时间依赖效力”部分，共聚焦显微成像显示，LAP-RI在SH-SY5Y细胞中的胞内荧光信号呈时间依赖性变化，其中1 h时胞内荧光最强，而2、4、6 h后荧光逐渐减弱。这一趋势与细胞毒性结果一致：最短预孵育时间对应最低IC₅₀值，说明LAP-RI在较短预照射孵育阶段具备最佳光激活与光动力活性。进一步的时间依赖IC₅₀分析显示，随着预孵育时间延长，两种细胞中的IC₅₀值均升高，提示光动力效力下降。这一现象支持LAP-RI作用高度依赖激活时机与细胞内处理过程。作者同时指出，延长孵育后活性下降虽然与最优酶促脱笼窗口相符，但在缺乏专门摄取和机制实验的前提下，亦不能排除化合物降解、外排或光物理淬灭等因素。

在“LAP3表达与酶依赖激活机制”部分，RT-qPCR结果表明，SH-SY5Y细胞中的LAP3基因相对表达量约为L929细胞的2倍。这一表达差异与两种细胞间约2倍的光毒性差异相呼应，支持LAP-RI在神经母细胞瘤细胞中的增强效应主要来源于LAP相关酶激活，而非单纯细胞系本身对光动力损伤的固有敏感性。论文进一步将该结果置于酶响应PDT文献背景中加以解释，指出单一酶触发、无纳米递送、无逻辑门放大和无多重靶向构型的最简系统，通常只产生幅度有限但统计学可重复的选择性差异，因此本研究观察到的约2倍选择性具有生物学可解释性和概念验证价值。

在“ROS介导机制”部分，研究人员通过ROS清除剂实验验证了LAP-RI光毒作用的活性氧依赖性。多种特异性清除剂均可减弱光毒性，其中叠氮化钠（NaN₃）这一单线态氧（¹O₂）清除剂的保护作用尤为显著，提示单线态氧在PDT过程中贡献突出。随后利用DCFH₂-DA探针检测胞内ROS生成，结果显示，SH-SY5Y细胞在IC₅₀浓度LAP-RI处理并接受光照后，绿色荧光显著增强，而加入NaN₃后该荧光明显减弱，进一步证实了LAP-RI的光毒作用依赖光触发ROS生成，且单线态氧是关键效应分子。结合既往数据，RI本身还具有较高的单线态氧量子产率（Φ_Δ = 54%），为其PDT效应提供了光物理学支持。

在“细胞死亡方式分析”部分，AO/EtBr双染结果显示，对照细胞主要呈绿色荧光，代表细胞存活；而经LAP-RI处理并光照后的SH-SY5Y细胞以黄橙色荧光为主，提示细胞膜通透性改变并以凋亡为主要死亡方式；红色荧光所代表的坏死细胞比例较低。加入NaN₃后，凋亡与坏死细胞数量均明显减少，说明ROS生成是介导LAP-RI细胞毒效应的关键事件。综合这些结果，研究人员认为LAP-RI介导的PDT主要通过ROS依赖机制诱导神经母细胞瘤细胞发生凋亡。

讨论部分围绕三个层面展开。其一，LAP-RI证明了以LAP为触发开关的单一酶响应型光敏剂可以在神经母细胞瘤中实现可控光动力激活，这在该肿瘤模型中属首次报道。其二，研究所观察到的选择性增强仅为温和水平，但这一结果与SH-SY5Y细胞中升高的LAP3表达相匹配，提示该体系真实反映了“酶限制性激活”特征，而不是依赖复杂多层放大结构获得的表观高选择性。其三，碘代间苯并吩噁嗪虽然合成便利、易于引入酶响应基团并可有效产生活性氧，但其吸收位于580–595 nm，低于通常认为更适合组织穿透的治疗窗口，因此当前体系更适合作为体外机制验证和概念验证平台，而非已优化的临床候选药物。文章据此强调，未来应将同一亮氨酸响应模块迁移至更长波长或近红外（near-infrared，NIR）光敏骨架，以提升组织穿透能力和转化潜力。

研究结论部分可译为：总之，研究人员通过5步合成首次成功构建了LAP可激活型碘代间苯并吩噁嗪。该光敏剂在LAP响应基团被酶切后，于水相中表现出显著的吸收与发射“开启”响应，并能够高效生成单线态氧。体外实验在神经母细胞瘤细胞和健康成纤维细胞中评估了LAP-RI的光动力潜力，结果表明其在两类细胞中均几乎不存在暗毒性。经LED照射后，LAP-RI在SH-SY5Y细胞中较L929成纤维细胞表现出温和但可重复的光毒性增强。该差异来源于酶依赖性激活，而非细胞对毒性敏感性的巨大内在差异，这与简化体外条件下单触发可激活型光敏剂的预期行为一致。最大光动力效能出现在较短预孵育时间，对应最低IC₅₀值和最高胞内激活水平，而延长孵育则导致光激活和效力下降。尽管这种时间—效力反向关系与最优酶促脱笼一致，但在缺乏专门摄取和机制实验情况下，不能排除LAP-RI降解、外排或光物理淬灭等其他因素。重要的是，LAP-RI介导的光毒性伴随着细胞内ROS显著增加，且在单线态氧清除剂NaN₃存在时明显受抑，证实其作用机制依赖ROS。进一步的细胞死亡分析表明，LAP-RI可诱导神经母细胞瘤细胞发生凋亡。SH-SY5Y细胞更高的光动力响应还与升高的LAP3基因表达相关，支持LAP-RI的酶依赖性激活，而非明确的肿瘤内在选择性。总体而言，这些发现确立了LAP-RI作为一种有效的酶可激活型光敏剂，其兼具ROS介导的凋亡效应和温和的酶限制性差异响应。因此，LAP-RI更应被理解为一种概念验证性质的酶可激活光敏平台，强调其作为可控分子系统的价值，而非已完全优化的治疗药物。该研究突出了可激活试剂在推进颅外肿瘤光动力治疗策略中的关键作用，并表明LAP-RI的价值并不在于细胞系间形成巨大IC₅₀分离，而在于其可控、酶响应性激活机制，为未来提升光动力治疗的空间精确性与分子精确性提供了合理基础。