动态流动免疫层析检测技术在牛和羊光滑型布鲁氏菌抗体快速血清学检测中的应用

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Rapid serological detection of smooth Brucella strain antibodies in bovine and sheep using a dynamic flow immunochromatographic test

　　

布鲁氏菌病是一种严重的人畜共患病，每年人类病例超过200万例，对畜牧业和公共卫生构成重大威胁。动物的早期准确诊断对于疾病控制至关重要，但现有方法往往耗时、依赖设备且易出现交叉反应。本研究开发了一种经济高效的动态流动免疫层析（DFICT）技术，用于牛和羊光滑型布鲁氏菌病的准确诊断。该检测方法采用固定有光滑型脂多糖（Smooth lipopolysaccharide）和链球菌蛋白G（Streptococcus protein G, SPG）作为检测线（T线）和质控线（C线）的检测试纸条，并以胶体金标记的SPG作为示踪剂。进行DFICT检测时，向试剂孔加入100 μL液体结合物，随后向样品孔加入5 μL血清，10分钟内即可肉眼观察结果。DFICT表现出高灵敏度，可检测到稀释度高达1:64的血清抗体，且具有卓越的特异性，与其他常见病原体无交叉反应。DFICT在4 °C下可保存12个月，其灵敏度和特异性无损失。利用80份牛血清和161份羊血清进行的临床验证显示，该方法与标准方法（酶联免疫吸附试验ELISA、虎红平板凝集试验RBT）具有良好的一致性，灵敏度分别达到94.6%（牛）和98.2%（羊），特异性分别为100%和84.0%。该研究建立的DFICT操作简便、无需设备且结果可靠，是大规模现场筛查的重要工具，显著增强了光滑型布鲁氏菌病的监测和控制能力。

论文解读：《动态流动免疫层析检测技术在牛和羊光滑型布鲁氏菌抗体快速血清学检测中的应用》

研究背景与意义

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌属（Brucella）引起的一种广泛传播的人畜共患病，主要感染牛、羊和山羊等家畜，对公共卫生和农业经济构成重大风险。每年全球报告的人类病例超过200万例，其传播主要通过接触受感染动物或食用受污染的产品。布鲁氏菌感染的临床影响主要集中在生殖道，导致孕畜晚期流产、胎衣不下及乳腺定植，进而通过乳汁污染环境并造成水平传播。由于部分地区常混合饲养牛、羊、山羊，增加了种间传播风险，因此迫切需要一种能够同时适用于牛和羊的早期、准确的感染动物检测方法。

目前的诊断方法存在诸多局限。细菌分离培养虽为金标准，但需生物安全三级实验室，耗时长且不实用。血清学检测如虎红平板凝集试验（RBT）、补体结合试验（CFT）和血清试管凝集试验（SAT）虽然常用，但易受其他细菌非特异性交叉反应影响导致假阳性，且结果判读主观性强。先进的分子生物学和血清学技术如酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR（RT-qPCR）虽然提高了灵敏度，但依赖昂贵仪器和专业技术人员，限制了其在现场的快速应用。虽然免疫层析检测（ICT）因其操作简便、成本低廉和快速出结果的特点成为有前景的即时检测平台，但现有的动物布鲁氏菌病ICT多为单一物种设计，且在制造复杂性、样本量需求和生产成本方面仍存在障碍。为此，研究人员基于前期开发的动态流动免疫层析检测（DFICT）平台，针对牛和羊的布鲁氏菌病检测进行了适应性研究，旨在提供一种统一、可靠且适合现场使用的解决方案。

主要关键技术方法

研究人员采用了一系列关键技术以建立和优化DFICT系统。首先，从羊种布鲁氏菌（Brucella melitensis）S2308株中提取并纯化光滑型脂多糖（S-LPS），并通过SDS-PAGE电泳和Western Blot验证其纯度与活性。其次，通过柠檬酸三钠还原法制备平均粒径为12.7 nm的胶体金颗粒，并将其与链球菌蛋白G（SPG）偶联，制备成液体示踪剂。在试纸条组装方面，研究人员摒弃了传统ICT所需的结合垫和样品垫，直接在硝酸纤维素（NC）膜上喷涂S-LPS作为捕获抗原（T线）和SPG作为质控抗原（C线），并将液体金-SPG结合物作为独立试剂。临床验证阶段，研究人员收集了来自中国不同养殖场的80份牛血清和161份羊血清（包括接种和未接种疫苗的动物），将DFICT结果与商业化的RBT、间接ELISA（iELISA）和竞争ELISA（cELISA）结果进行平行比对，并利用ImageJ软件对智能手机拍摄的试纸条图像进行灰度值定量分析，计算T线与C线的信号强度比（T/C）。

研究结果

3.1 布鲁氏菌LPS的制备

研究人员成功提取了布鲁氏菌LPS。银染结果显示LPS条带均匀分散，考马斯亮蓝染色未检测到蛋白质污染，Western Blot验证了其与布鲁氏菌抗体的特异性结合能力。这证实了提取的LPS结构完整、纯度高，适合作为捕获抗原。

3.2 金-SPG结合物的制备

透射电子显微镜（TEM）表征显示制备的胶体金颗粒呈球形且单分散，平均直径为12.7 nm。紫外-可见光谱分析表明，原始金纳米粒子的特征吸收峰在520 nm，而SPG偶联后发生红移至524 nm。这证实了胶体金-SPG结合物的成功制备，且其合成与偶联方案成熟，有利于产品开发。

3.3 DFICT试纸条的检测程序与原理

DFICT的操作流程为：先在试剂孔（R）加入100 μL金-SPG结合物，待其沿NC膜毛细管流动后，在样品孔（S）加入5 μL血清样本。检测原理基于免疫反应：阳性样本中的抗LPS抗体与金-SPG结合物形成复合物，迁移至T线与固定的LPS结合产生红色条带；未结合的复合物则被C线的SPG捕获产生第二条红色条带。阴性样本仅出现C线。若C线不出现，则试验无效。

3.4 DFICT试纸条的灵敏度

通过对标准阳性血清进行系列稀释测试，研究发现随着血清稀释度的增加，T线颜色逐渐变浅。在1:64的稀释度下，牛和羊的阳性血清仍能观察到清晰的红色T线。这表明DFICT具有较高的灵敏度，能够检测低浓度的特异性抗体。

3.5 DFICT试纸条的特异性

特异性评估显示，无论是羊还是牛的感染血清，只有感染布鲁氏菌的样本在T线和C线均出现明显的红色条带。而感染大肠杆菌O157（E. coli O157）、都柏林沙门氏菌（Salmonella dublin）、小肠结肠炎耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）、多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）口蹄疫病毒（FMDV）等其他病原体的血清均为阴性结果。证明DFICT对布鲁氏菌抗体检测具有高特异性，无交叉反应。

3.6 DFICT试纸条的稳定性

稳定性测试表明，在4 °C保存12个月后，DFICT试纸条仍保持与新鲜制备试纸条相同的灵敏度，能检出1:64稀释的阳性质控血清。在室温（RT）下，试纸条可保持其检测活性长达6个月，但在连续储存9个月后灵敏度有所下降。在整个储存期间，试纸条的特异性保持不变，未记录到假阳性结果。

3.7 诊断性能比较

对临床样本的检测结果表明，DFICT在牛血清中表现出94.6%的灵敏度和100%的特异性；在羊血清中灵敏度为98.2%，特异性为84.0%。与RBT、cELISA和iELISA相比，DFICT在牛血清中表现出极好的一致性（Kappa值接近1.000）。受试者工作特征（ROC）曲线分析进一步证实了其强大的诊断性能，牛血清的曲线下面积（AUC）为0.9246。尽管羊血清的AUC略低（0.8728），可能与复杂的血清基质效应有关，但总体表现依然良好。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出DFICT架构的优势在于省去了传统免疫层析中的血清稀释步骤，并利用液体胶体金-SPG结合物流线化了工作流程。相比于传统ICT需要制备结合垫并依赖真空干燥箱等设备，DFICT完全消除了干燥过程，不仅简化了生产工艺、提高了产量，还降低了对湿度的严格控制要求，从而大幅削减了制造成本。选择重组SPG而非金黄色葡萄球菌蛋白A（SPA）是因为SPG对反刍动物免疫球蛋白具有更强的结合亲和力，且能与多种物种的IgG结合，暗示了该试纸条在人类和其他动物布鲁氏菌病检测中的潜在应用价值。此外，DFICT的高特异性归因于高纯度LPS的提取工艺和优化的平台设计，最小化的血清用量（5 μL）也减少了交叉反应物质的引入。

然而，研究人员也指出了该方法的局限性，即使用光滑型布鲁氏菌S-LPS作为捕获抗原主要检测抗S-LPS抗体，因此无法区分野毒感染产生的抗体与疫苗接种（如羊种M5疫苗和牛种A19疫苗）诱导的抗体。这在监测净化区可能会带来分类挑战。尽管如此，DFICT凭借其简单的操作、快速的出结果能力（约10分钟）和高商业化潜力，非常适合在资源有限的环境和现场条件下进行大规模布鲁氏菌病筛查。未来的工作将集中于开发基于智能手机的定量分析技术，并优化样本处理方案以增强DFICT的抗干扰能力，从而在“全健康（One Health）”框架下进一步扩展其应用。