ALDOC调控阿尔茨海默病中星形胶质细胞糖酵解及AMPK/mTOR/HIF-1α信号通路

《Frontiers in Neuroscience》：ALDOC modulates astrocytic glycolysis and AMPK/mTOR/HIF-1α signaling in Alzheimer’s disease

　　

目的：星形胶质细胞为神经元提供关键代谢支持，并在阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）中发生显著代谢改变。星形胶质细胞富集的糖酵解酶醛缩酶C（Aldolase C, ALDOC）可能参与此过程。本研究旨在探讨ALDOC是否通过调节星形胶质细胞代谢以支持AD患者神经元能量供给及其治疗潜能。方法：对6月龄APP/PS1及野生型小鼠海马和皮质组织进行蛋白质印迹（Western Blotting）、实时荧光定量PCR（qPCR）及免疫荧光染色检测ALDOC及糖酵解相关蛋白；采用寡聚β-淀粉样蛋白（oligomeric β-amyloid, oAβ）处理人SVGp12星形胶质细胞系建立体外AD模型，通过质粒过表达或siRNA敲低ALDOC，经蛋白质印迹、qPCR、乳酸/ATP检测及细胞外酸化率（extracellular acidification rate, ECAR）测定评估其对AMPK/mTOR/缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）信号及糖酵解标志物（乳酸脱氢酶A[lactate dehydrogenase A, LDHA]和丙酮酸激酶M2[pyruvate kinase M2, PKM2]）的下游影响；通过SVGp12与SH-SY5Y神经元共培养评估神经元-星形胶质细胞相互作用；并测试镁离子（Mg2+）恢复ALDOC表达的能力。结果：ALDOC特异性表达于星形胶质细胞，在APP/PS1小鼠中表达下调，伴随HIF-1α及LDHA降低，提示糖酵解受损；oAβ处理的SVGp12细胞中ALDOC亦下调。ALDOC过表达伴随AMPK/mTOR/HIF-1α信号改变、糖酵解增强及乳酸和ATP生成增加，而敲低则相反；挽救实验表明该效应依赖于HIF-1α。共培养中星形胶质细胞ALDOC过表达可支持神经元代谢功能。此外，镁离子可恢复oAβ处理星形胶质细胞中ALDOC活性及糖酵解。结论：ALDOC在APP/PS1小鼠中下调并与糖酵解障碍相关；在oAβ处理的星形胶质细胞中，ALDOC可能通过AMPK/mTOR/HIF-1α轴调控糖酵解，并通过乳酸穿梭支持神经元能量供给；镁离子或为纠正AD代谢缺陷的潜在策略。

论文解读：ALDOC调控阿尔茨海默病中星形胶质细胞糖酵解及AMPK/mTOR/HIF-1α信号通路

研究背景与立项依据

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease, AD）是一种以认知衰退为特征的神经退行性疾病，病理特征为β-淀粉样蛋白（β-amyloid, Aβ）斑块及神经纤维缠结。脑高度依赖葡萄糖供能，神经元主要经氧化磷酸化（oxidative phosphorylation, OXPHOS）产生ATP，而星形胶质细胞倾向通过糖酵解产生乳酸，经单羧酸转运体（monocarboxylate transporters, MCTs）转运至神经元供能，即星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭（astrocyte–neuron lactate shuttle, ANLS）。AD中存在慢性代谢失调，Aβ暴露可致星形胶质糖酵解受损、乳酸生成减少及神经元能量衰竭。醛缩酶家族（ALDOA、ALDOB、ALDOC）催化果糖-1,6-二磷酸（fructose-1,6-bisphosphate, FBP）裂解为甘油醛-3-磷酸和二羟丙酮磷酸，ALDOC为脑特异性异构体且富集于星形胶质细胞，在AD患者中表达降低且与葡萄糖代谢受损相关，但其具体机制不明。AMP活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase, AMPK）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin, mTOR）/缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α）轴是代谢重编程的核心通路。镁（Magnesium, Mg）是包括醛缩酶在内的300余种酶的必需辅因子，缺镁与AD相关，但其能否上调星形胶质ALDOC尚不清楚。本研究旨在明确ALDOC在AD星形胶质细胞糖代谢中的调控作用及Mg的干预潜力。本文发表于《Frontiers in Neuroscience》。

主要关键技术方法

研究人员采用6月龄雄性APP/PS1转基因小鼠及同窝野生型（Wild-Type, WT）C57BL/6小鼠，取海马及皮质组织；制备寡聚Aβ_1-42（oligomeric Aβ, oAβ）体外处理人SVGp12星形胶质细胞系建立AD细胞模型；通过脂质体转染pcDNA3.1(+)-ALDOC过表达质粒及靶向ALDOC或HIF-1α的siRNA进行基因操纵；运用蛋白质印迹（Western Blot）检测ALDOC、磷酸化/总AMPK（p-AMPK/AMPK）、磷酸化/总mTOR（p-mTOR/mTOR）、HIF-1α、LDHA、PKM2、谷氨酸转运体-1（glutamate transporter-1, GLT-1）、微管相关蛋白Tuj1、MCT2及内参，qPCR检测mRNA水平，免疫荧光染色观察共定位；测定细胞内ATP含量、乳酸生成量及细胞外酸化率（ECAR）；JC-1探针检测线粒体膜电位；建立Transwell共培养体系将SVGp12（下室）与SH-SY5Y神经细胞（上室）共培养，并用MCT2抑制剂AR-C155858验证乳酸穿梭依赖性；用不同浓度硫酸镁（MgSO₄）处理oAβ刺激的细胞，通过ALDOC敲低确认Mg作用是否依赖ALDOC。

研究结果

Downregulation of ALDOC is accompanied by decreased expression of key glycolytic proteins in APP/PS1 mice

研究人员发现APP/PS1小鼠海马和皮层中ALDOC蛋白及mRNA显著低于WT小鼠，伴随HIF-1α和LDHA蛋白及mRNA同步下调；免疫荧光显示ALDOC与星形胶质标志物GFAP（Glial Fibrillary Acidic Protein）高度共定位而与神经元标志物NeuN低共定位，且Aβ斑块周围反应性星形胶质中ALDOC、HIF-1α、LDHA荧光强度显著降低，证实AD模型星形胶质中ALDOC下调并伴糖酵解关键分子减少。

oAβ treatment reduces ALDOC expression and impairs glycolysis in astrocytes

研究人员用5 μM oAβ处理SVGp12细胞24 h，发现ALDOC蛋白和mRNA下降，p-AMPK/AMPK比值升高、p-mTOR/mTOR比值降低，HIF-1α、LDHA、PKM2蛋白和mRNA均下调；功能上乳酸水平、ECAR及细胞内ATP含量显著降低，线粒体膜电位（JC-1红/绿比）下降，GLT-1表达减少，说明oAβ致星形胶质ALDOC下调并引起糖酵解抑制及功能受损。

ALDOC regulates glycolytic capacity in oAβ-treated astrocytes through HIF-1α

研究人员在oAβ处理的细胞中过表达ALDOC可使p-AMPK/AMPK降低、p-mTOR/mTOR及HIF-1α、LDHA、PKM2升高，乳酸、ECAR和ATP恢复；敲低ALDOC则加重上述指标恶化。挽救实验显示：ALDOC过表达背景下敲低HIF-1α可阻断LDHA/PKM2上调及糖酵解恢复；而ALDOC敲低背景下过表达HIF-1α可逆转LDHA/PKM2下降及代谢指标，证明ALDOC调控糖酵解依赖于HIF-1α，并涉及AMPK/mTOR/HIF-1α轴。

ALDOC overexpression in astrocytes improves neuronal energy support in a coculture model

研究人员共培养SH-SY5Y与SVGp12，oAβ处理星形胶质降低神经元MCT2表达及ATP，而星形胶质ALDOC过表达可恢复MCT2和神经元ATP；用MCT2抑制剂AR-C155858阻断神经元乳酸摄取后，神经元胞内乳酸下降、ATP减少、存活率降低且抵消ALDOC过表达的护作用，表明星形胶质ALDOC增强糖酵解产乳酸经由MCT2介导的ANLS支持神经元能量。

Magnesium upregulates ALDOC expression, thereby promoting glycolytic flux in oAβ-treated astrocytes

研究人员用1、4、8 mM MgSO₄处理oAβ刺激细胞，4 mM MgSO₄显著提升ALDOC、HIF-1α、LDHA蛋白及乳酸、ECAR、ATP；预先敲低ALDOC后MgSO₄不再引起上述分子及代谢指标升高，说明Mg促进星形胶质糖酵解流是通过上调ALDOC介导的。

讨论与结论总结

讨论指出本研究表明AD模型及oAβ处理的星形胶质中ALDOC下调伴AMPK/mTOR/HIF-1α信号改变和糖酵解受损；ALDOC通过HIF-1α依赖方式调节糖酵解；星形胶质ALDOC过表达经MCT2乳酸穿梭改善神经元能量；4 mM MgSO₄上调ALDOC恢复糖酵解，且此效应依赖ALDOC。研究局限包括未证实ALDOC与AMPK直接因果、使用细胞系而非原代细胞或体内星形胶质特异操控、部分样本量有限及Mg机制未深入。未来需在原代共培养及体内验证。

结论翻译（Concluding Remarks）：

这些结果表明ALDOC在APP/PS1小鼠中下调并与糖酵解损伤相关；在oAβ处理的星形胶质细胞中，ALDOC似乎通过AMPK/mTOR/HIF-1α轴调节糖酵解，并可能经由乳酸穿梭支持神经元能量供给；镁离子似为应对AD代谢缺陷的潜在策略。