《RSC Advances》：Unveiling the antioxidant and anti-epileptic potential of Castanea sativa against pentylenetetrazole in mice: a comparative LC-MS analysis of two ethanol-based fractions
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癫痫是一种慢性神经系统疾病，其发病机制中氧化应激（oxidative stress）与神经炎症（neuroinflammation）具有关键致病作用。天然抗氧化剂因其神经保护特性而作为辅助疗法受到日益广泛的关注。欧洲栗（Castanea sativa, C.
癫痫是一种慢性神经系统疾病，其发病机制中氧化应激（oxidative stress）与神经炎症（neuroinflammation）具有关键致病作用。天然抗氧化剂因其神经保护特性而作为辅助疗法受到日益广泛的关注。欧洲栗（Castanea sativa, C. sativa）果实富含酚酸（phenolic acids）和黄酮类化合物（flavonoids），可能具有此类治疗潜力。本研究旨在评估欧洲栗不同组分对戊四氮（pentylenetetrazol, PTZ）诱导小鼠癫痫的影响，通过调节脑内γ-氨基丁酸（Gamma-Aminobutyric acid, GABA）、兴奋性氨基酸转运体2（Excitatory amino acid transporter 2, EAAT2）、肿瘤坏死因子-α（Tumor Necrosis Factor-alpha, TNF-α）及丙二醛（Malondialdehyde, MDA）水平发挥作用。研究人员采用70%和100%乙醇依次提取欧洲栗果实，获得两种组分，并通过液相色谱-质谱联用（liquid chromatography-mass spectrometry, LC-MS）进行植物化学特征分析。体外抗氧化能力通过DPPH、ABTS和FRAP实验评估。体内疗效采用PTZ诱导的癫痫小鼠模型进行评价，实验动物分别给予溶媒、地西泮（diazepam, 1 mg kg?1）或欧洲栗提取物（400 mg kg?1）灌胃，于PTZ注射（60 mg kg?1）前30分钟给药。LC-MS分析鉴定出超过70种代谢产物，主要为酚酸（鞣花酸和没食子酸衍生物）、黄酮苷（槲皮素和山奈酚）以及若干新颖木脂素（lignans）和环烯醚萜苷（iridoid glycosides）。100%乙醇组分表现出更高的化学多样性和峰强度，以及显著更强的抗氧化活性，其DPPH和ABTS的IC50值更低（分别为193.65 μg mL?1和128.87 μg mL?1），FRAP能力（26.59 μg TE mg?1 fraction）较70%乙醇组分高约近5倍。在体内实验中，100%提取物使癫痫发作潜伏期延长2.8倍，并减少发作持续时间和死亡率，疗效接近地西泮。此外，两种提取物均能提高脑内GABA、EAAT2和还原型谷胱甘肽（Glutathione, GSH）水平，同时降低MDA、TNF-α和核因子-κB（Nuclear Factor kappa-B, NF-κβ）水平。上述发现支持欧洲栗果实提取物尤其是100%乙醇组分的抗氧化和神经保护潜力，提示其作为功能性食品成分或癫痫管理的营养补充剂具有良好的应用前景。
癫痫作为全球约5200万人罹患的慢性神经系统疾病，其主要特征为反复癫痫发作，伴随意识改变、行为异常或剧烈抽搐等症状。尽管约35%患者对标准抗癫痫药物治疗反应不佳，现有治疗策略仍存在明显局限。癫痫发病机制涉及氧化应激、神经炎症、神经元丢失及神经传递紊乱等多因素，其中活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生导致的氧化损伤日益受到重视。γ-氨基丁酸（GABA）作为中枢神经系统主要抑制性神经递质，其与兴奋性信号的平衡失调是癫痫发作的重要机制；而兴奋性氨基酸转运体2（EAAT2）作为最主要的谷氨酸转运体，在调节细胞外谷氨酸水平、防止兴奋毒性方面发挥关键作用，成为癫痫神经保护治疗的潜在靶点。
欧洲栗（Castanea sativa Mill.）为壳斗科落叶乔木，广泛栽培于欧洲、北非及小亚细亚地区，其坚果富含碳水化合物、不饱和脂肪酸、优质蛋白、维生素（尤其是维生素C和E）及钾、镁、铁等必需矿物质。除营养价值外，欧洲栗因含有多酚、黄酮、鞣质、鞣花酸及没食子酸衍生物等大量生物活性成分，展现出抗氧化、抗炎、抗菌及潜在神经保护活性，在功能性食品和天然治疗药物开发中备受关注。传统上，欧洲栗的叶、树皮和果实等部位被民间医学用于治疗咳嗽、腹泻和炎症等疾病，其民族药理学价值与现代药理学研究相契合。基于此背景，研究人员开展了欧洲栗果实乙醇提取物的抗氧化和神经保护作用研究，旨在探索其对氧化应激相关神经系统疾病特别是癫痫的保护潜力，并通过LC-MS全面表征其组分特异性植物化学物质。该研究发表于《RSC Advances》。
研究人员采用的技术方法主要包括：超高效液相色谱-高分辨串联质谱（UPLC-HRMS/MS）结合基于特征的分子网络（feature-based molecular networks, FBMN）进行代谢组学分析；DPPH自由基清除、ABTS自由基阳离子脱色及FRAP三种体外抗氧化实验；PTZ诱导的癫痫小鼠模型（雄性瑞士小鼠，20–35 g）进行体内药效评价；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测脑组织MDA、GSH、TNF-α、GABA和EAAT2水平；以及苏木精-伊红（H&E）染色进行脑组织病理学观察。
代谢组学分析结果显示，研究人员通过UPLC-HRMS/MS在正负离子模式下对两种乙醇提取物进行分析，基峰色谱图（base peak chromatogram, BPC）显示100%乙醇提取物（CS 100）中检测到的代谢产物丰度显著更高。通过全球天然产物社会分子网络（GNPS）平台构建FBMN进行可视化分析，共注释鉴定出73种代谢产物，涵盖酚酸、脱辅基类胡萝卜素（apocarotenoids）、生物碱、黄酮、萜类、芪类、木脂素、环烯醚萜等多个类别，其中超过70%的注释特征为首次在欧洲栗提取物中报道。
酚类化合物方面，鉴定出没食子酸、乙基没食子酸酯、咖啡酸等简单酚类，以及二羟基苯甲酸、尿黑酸等其他酚酸，还有O-没食子酰红景天苷等糖基化酚酸和苯乙基-O-樱草糖苷等复杂糖苷。生物碱类检测到次黄嘌呤、黄嘌呤和喹啉二醇等具有神经保护和抗炎活性的含氮化合物。黄酮类含量丰富，包括花旗松素、槲皮素和木犀草素等，以及槲皮素二甲醚硫酸盐、二-O-甲基浮计量等修饰形式，还检测到（表）儿茶素-O-己糖苷、槲皮素-O-己糖苷和丁香亭-O-葡萄糖苷等多种黄酮苷。芪类化合物如三羟基芪-O-己糖苷和云杉新苷-2″-O-香豆酸酯也被注释。尤为重要的是，研究首次在欧洲栗中报道了多种木脂素，包括异落叶松脂素-O-己糖苷异构体、里昂树脂醇-O-己糖苷和罗汉松脂素等。此外还鉴定出kanokoside A、agnucastoside B等环烯醚萜及hydrogeniposide等环烯醚萜苷，以及二氢 phases酸-O-己糖苷、blumenol C己糖苷等倍半萜和脱辅基类胡萝卜素，canavalioside和cinnacaside等二萜，还有色氨酸等氨基酸衍生物和多种香豆素。总体而言，LC-MS分析揭示欧洲栗具有异常丰富多样的次生代谢组，木脂素和环烯醚萜类的新注释化合物尤为突出，酚类化合物（包括黄酮和酚酸）的优势与其传统抗氧化和药用价值一致。
体外抗氧化活性结果显示，两种欧洲栗组分均表现出显著的剂量依赖性抗氧化活性，但100%乙醇组分在所有方法中均显著优于70%乙醇组分。DPPH实验中，100%组分IC
50为193.65 ± 0.50 μg mL
?1，较70%组分（228.77 ± 1.99 μg mL
?1）约强1.18倍；ABTS实验中，100%组分IC
50为128.87 ± 0.40 μg mL
?1，较70%组分（178.97 ± 1.79 μg mL
?1）约强1.39倍；FRAP实验中，100%组分铁离子还原能力达26.59 ± 1.77 μg TE mg
?1，为70%组分（5.17 ± 0.35 μg TE mg
?1）的5倍以上。100%组分化学多样性更高，含有额外的倍半萜（脱辅基类胡萝卜素）、环烯醚萜苷以及更多样的酚酸和黄酮，这种增强的植物化学多样性是其优越抗氧化性能的基础。
癫痫发作评分与潜伏期结果显示，PTZ注射导致小鼠出现耳面部抽搐、躯体抽搐波、肌阵挛性抽动、翻身侧卧及翻身仰位等典型癫痫行为。与PTZ组相比，70%乙醇提取物延迟耳面部抽搐56%，100%乙醇提取物延迟100%；对躯体抽搐波的延迟分别为46%和88%；对肌阵挛性抽动的延迟分别为20%和93%；对翻身侧卧的延迟分别为41%和76%；对翻身仰位（伴全身强直-阵挛发作）的延迟分别为67%和89%。100%乙醇提取物在减少耳面部抽搐、躯体抽搐波、肌阵挛性抽动、翻身侧卧及翻身仰位方面，分别较地西泮优效100%、83%、63%、177%和26%。
氧化应激指标结果显示，PTZ使脑组织MDA升高116%、GSH降低35%，表明癫痫发作伴随显著氧化损伤。欧洲栗70%和100%乙醇提取物分别使MDA降低24%和42%，使GSH升高30%和48%；100%提取物在降低MDA和恢复GSH方面分别较地西泮优效11%和5%。
炎症与神经递质结果显示，PTZ致?组脑内TNF-α、GABA和EAAT2水平较正常对照分别降低50%、57%和25%。欧洲栗70%和100%乙醇提取物分别使TNF-α恢复27%和33%，使GABA恢复22%和64%，使EAAT2恢复13%和32%；100%提取物在降低TNF-α和恢复EAAT2方面分别较地西泮优效7%和9%。研究人员认为，欧洲栗乙醇提取物不仅通过抗氧化机制，还通过抑制炎症和调节细胞因子活性发挥神经保护作用，其抑制NF-κB激活和降低TNF-α表达的能力源于多酚化合物（特别是鞣质、木脂素和没食子酸衍生物）的协同作用。EAAT2和GABA水平的升高、MDA和TNF-α的降低共同指向欧洲栗对PTZ诱导脑损伤的强神经保护潜力。
组织病理学结果显示，正常组大脑皮层和海马结构完整；PTZ组皮层神经元出现变性、结构改变、染色变淡、胞体皱缩、核固缩，周围神经毡空泡化，可见神经胶质细胞围绕扩张充血的毛细血管灶性聚集；海马CA区锥体细胞层厚度显著降低，DG区颗粒细胞层变薄、胞质嗜碱性、核固缩伴晕环现象及核溶解，锥体细胞轴突水肿变性表现为分子区苍白空泡区域。地西泮治疗组皮层结构保存良好。70%乙醇提取物组皮层结构部分保存，部分神经元正常，部分皱缩伴核深染。100%乙醇提取物组皮层结构正常，神经元形态正常，锥体细胞核圆、开放面核、胞质嗜碱性，颗粒细胞开放面核及明显核仁。海马区100%提取物组接近正常显微结构，CA区典型三层结构保存，锥体细胞胞质嗜碱性、中央泡状核，DG颗粒细胞结构保留，多形层和分子层可见深染的胶质细胞和中间神经元。
讨论部分，研究人员指出组织病理学结果证实欧洲栗乙醇提取物具有神经保护作用，能够改善癫痫所致损伤，这与其活性成分的抗氧化和抗炎特性相关。癫痫发作导致海马和皮层锥体层厚度显著降低、存活锥体细胞减少， dark neurons（暗神经元）的形成与兴奋性神经递质释放导致的细胞骨架早期损伤有关。反应性胶质增生也是癫痫发生的重要因素，活化的星形胶质细胞和小胶质细胞通过释放炎性细胞因子和大量ROS加剧神经毒性。治疗组4（100%提取物）显示出神经保护和神经再生效应，减少了海马和皮层的神经元丢失。
研究结论部分指出，欧洲栗乙醇提取物特别是100%组分具有显著的抗氧化和神经保护特性。该组分表现出最高的化学复杂性和生物活性，LC-MS鉴定出黄酮、酚酸、木脂素和环烯醚萜等多种生物活性化合物。其自由基清除能力和还原力优于70%组分。在癫痫模型中，100%组分有效缓解氧化应激、减轻炎症并调节神经递质水平。这些结果凸显了该组分在治疗氧化应激相关神经系统疾病中的治疗前景，同时支持欧洲栗不仅在药物开发中，而且作为功能性成分应用于营养补充剂和脑支持食品的潜力。
