基于分子网络的气相色谱-质谱联用技术分析 Citrus japonica Thunb. 果皮与果肉的亲脂性组分及其对糖尿病足溃疡病原体的抗菌潜力

《Scientific Reports》：Molecular networking-based GC/MS profiling of Citrus japonica Thunb. peel and pulp lipophilic fractions and their antimicrobial potential against diabetic foot ulcer pathogens

　　

糖尿病溃疡是糖尿病的一种严重并发症，常因微生物感染而加重，阻碍伤口愈合。该研究探讨了源自 Citrus japonica（金柑）果皮和果肉的非极性成分的抗菌潜力，将其作为管理糖尿病溃疡相关微生物感染的天然抗菌剂。基于气相色谱-质谱联用（GC-MS）的分子网络技术丰富了果皮和果肉亲脂性组分中化合物的注释，分别鉴定出113种和92种化合物。此外，初步的体外抗菌试验表明，果肉非极性提取物对常见的糖尿病溃疡病原体具有弱至中等的效力，包括铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白念珠菌（Candida albicans），其抑菌圈直径（mm）分别为13.汗出他们在管理雪地.67 ± 0.89、19.33 ± 0.22和20.5 ± 0.17，对照标准品分别为12.33 ± 0.22、19.83 ± 0.39和10.71 ± 0.05；最低抑菌浓度（MIC）值（mg/mL）分别为3.75 ± 0.04、0.938 ± 0.002和1.88 ± 0.001。此外，基于主成分分析（PCA）的GC-MS揭示了果皮和果肉亲脂性组分化学特征的显著差异，其中果肉显示出更高浓度的三甲基柠檬酸酯（trimethyl citrate）和壬二酸酯（azelaic acid ester），这些化合物与抗菌和抗真菌特性相关。这一发现表明，非极性物质，特别是来自果肉的物质，可能是治疗糖尿病溃疡的有前景的天然抗菌剂。需要进一步研究以评估其在临床应用中的疗效，并探索其在促进伤口愈合和预防感染方面的作用机制。

该研究聚焦于糖尿病足溃疡（diabetic foot ulcer, DFU）这一糖尿病严重并发症的微生物感染管理问题。全球约有5.37亿人患有糖尿病，其中19%至34%会在其一生中发生糖尿病足溃疡。糖尿病足溃疡若未得到适当治疗，可能进展为骨髓炎、坏疽，最终导致肢体截肢，死亡率显著增加。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）是最常分离的细菌菌株，而白念珠菌（C. albicans）也是糖尿病足感染中反复鉴定的临床相关真菌分离株。

Citrus japonica（金柑）属于芸香科柑橘属，原产于南亚和亚太地区，其果实通常连皮整颗食用。在民间医学中，金柑一直被用于治疗咳嗽、感冒和其他呼吸道炎症。尽管金柑与多种健康益处相关，但其植物化学和生物学特性研究明显不足，特别是果皮与果肉的亲脂性组成比较研究更为匮乏。已有研究表明金柑果皮精油具有强效抗菌特性，但其果肉部分的亲脂性成分及其生物活性尚未得到充分探索。

该研究旨在通过基于全球天然产物社会分子网络（GNPS）的分子网络技术，首次比较金柑果皮与果肉的亲脂性代谢组，并初步筛选这些组分对糖尿病足溃疡相关病原体的抗菌活性。该论文发表于《Scientific Reports》。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合GNPS分子网络进行代谢组学分析；通过Property Component Analysis（PCA）进行化学计量学分析以区分果皮与果肉的代谢特征；以及采用琼脂孔扩散法和微量肉汤稀释法进行体外抗菌活性评价。

研究结果部分，化学调查与基于GC-MS的分子网络分析显示，GC-MS分析揭示了所研究果皮和果肉提取物中不可皂化物质（USFPl和USFPp）以及脂肪酸酯（FAEPl和FAEPp）的显著差异。通过GC-MS鉴定，USFPl和USFPp分别含有49种和46种化合物，分别占总峰面积的82.646%和94.368%。果皮中丁基羟基甲苯（butylated hydroxytoluene, 10.58%）和柠檬烯（limonene, 2.23%）的含量显著高于果肉（分别为1.67%和0.26%），而柠檬烯氧化物（limonene oxide）在果肉中大量积累（14.448%），果皮中仅痕量存在（0.13%）。FAEPl和FAEPp分别鉴定出53种和46种化合物，甲基棕榈酸酯（methyl palmitate）为两部位的主要化合物（分别为9.597%和22.872%），其次是壬二酸二甲酯（dimethyl azelate, 6.518%和7.51%）。值得注意的是，癸二酸（azelaic acid）衍生物和柠檬酸三甲酯（trimethyl citrate, 7.3%）在果肉中被检测到。

主成分分析结果表明，基于可皂化和不可皂化组分Clinton获得的数据集，PCA双标图显示了金柑果皮与果肉之间的清晰分离。对于可皂化物质，PC1和PC2分别解释了总方差的79.1%和20.9%；对于不可皂化物质，分别解释了58.3%和41.7%。在不可皂化物质中，PC2的正向与果皮相关，表明1-己醇、丁基羟基甲苯和柠檬烯等成分的富集；而果肉则富含烷基苯类化合物如2-苯基十一烷、2-苯基十二烷和5-苯基十二烷。在可皂化物质中，与果肉相关的正向载荷包括甲基棕榈酸酯、柠檬酸三甲酯、十八碳二烯酸甲酯和壬二酸二甲酯，而与果皮相关的负向载荷为十六烷酸乙酯（ethyl palmitate）。

抗菌调查研究显示，NPFPp对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白念珠菌表现出阳性抗菌效果，抑菌圈直径分别为13.67 ± 0.89 mm、19.33 ± 0.22 mm和20.5 ± 0.17 mm，与标准品相比，对铜绿假单胞菌和白念珠菌的活性显著高于阳性对照。MIC值分别为3.75 mg/mL、0.938 mg/mL和1.88 mg/mL。而NPFPl未显示出任何抗菌效果。

讨论部分，研究人员指出该研究利用基于代谢组学的GC-MS方法表征了金柑果实组织中的非极性代谢物，共鉴定出63种可皂化和55种不可皂化化合物。多变量PCA分析清楚地区分了两种组织，表明存在不同的代谢途径和潜在的生态功能。化学计量学分析进一步证明了生物活性成分的的组织特异性富集。烷基苯类化合物在两种组织中均有存在，但在USFPp中显著更高（58.53%），PCA highlighting phenyl decane derivatives as key discriminants。这些化合物此前已与植物的抗菌防御机制相关联。含氧单萜类化合物包括柠檬烯氧化物、芳樟醇等在两种组织中均有检测到，果皮中含量略高，这些化合物对革兰氏阴性菌具有增强的活性， attributed to oxygenated functional groups that increase membrane permeability。

更为重要的是，基于PCA的GC-MS表明果肉组分（FAEPp）的特征是含有更高水平的十六烷酸甲酯、柠檬酸三甲酯和壬二酸二甲酯。这些代谢物可能共同贡献了果肉相比于果皮更强的抗菌活性。长链脂肪酸甲酯类如十六烷酸甲酯已知可破坏微生物膜；柠檬酸衍生物可能通过金属离子螯合增强活性，从而 destabilizing cell envelope integrity and biofilm structure；壬二酸衍生物则通过抑制参与DNA和蛋白质合成的关键微生物酶来补充这一效果，FDA已批准其用于皮肤病治疗。

尽管观察到的MIC值（0.938–3.75 mg/mL）表明仅具有中等抗菌效力，但这与其他柑橘属提取物的报道值一致。这种中等活性是可预期的， given the complex, slightly non-purified nature of the lipophilic extracts, where multiple compounds may act synergistically or competitively。总体而言，果肉组分的适度但广谱抗菌活性很可能是由膜破坏活性脂肪酸酯、具有金属螯合特性的柠檬酸以及作为酶抑制剂的壬二酸之间的协同作用所驱动，而非单一主导成分的作用。

该研究作为金柑组织特异性生物活性的初步筛选，需要进一步的分离纯化以确立明确的构效关系，并验证最具活性代谢物的治疗潜力。

研究结论部分翻译如下：该研究首次基于GC-MS代谢组学比较了C. japonica果皮和果肉的非极性组分，辅以GNPS分子网络和PCA化学计量学分析。果肉组分富集了生物活性代谢物，包括柠檬酸三甲酯、壬二酸二甲酯和甲基棕榈酸酯，并对糖尿病足感染中常见的三种病原体（P. aeruginosa、S. aureus和C. albicans）表现出弱至中等的体外抗菌活性。这些发现表明，观察到的活性是由多种化合物协同作用(Material affecting microbial membranes, metal ion balance, and enzymatic pathways)所驱动。总之，C. japonica的果肉组分代表了有前景的抗菌先导化合物来源，值得进一步进行分离纯化、体外试验（生物膜、细胞毒性和伤口愈合）以及体内验证。