婴儿期前额叶皮层中基因表达网络的人类特异性属性图谱绘制

《SCIENCE ADVANCES》：Charting the human-specific properties of gene expression networks in the infant prefrontal cortex

　　

人类婴儿期的特征是脑发育进程延长，并与广泛突触重塑的敏感期相重叠。由于在近缘灵长类物种中缺乏可比材料，当前尚不清楚这一过程是否由人类婴儿特异性的转录程序所支持。研究人员在本研究中利用罕见的新生黑猩猩样本以及与其年龄匹配的人类和恒河猴脑组织样本，开展了单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）与表观基因组学（epigenomics）分析。研究鉴定出一种存在于未成熟少突胶质细胞（oligodendrocytes, OLs）中的人类婴儿特异性转录程序，该程序在孤独症（autism）风险基因及患者基因表达改变中呈过度代表。进一步地，研究还鉴定出一种存在于神经谱系中的人类婴儿特异性转录程序，该程序在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）风险基因及患者基因表达改变中同样呈过度代表。这两类程序均属于一个核心转录网络，该网络包含调控性DNA中的人类特异性序列改变，并且缺乏细胞谱系特异性。本研究为理解早期婴儿阶段人类演化的阶段特异性属性提供了见解，并揭示了人类对神经系统疾病具有特异性易感倾向的线索。

这篇发表于《SCIENCE ADVANCES》的研究聚焦于人类婴儿早期前额叶皮层（prefrontal cortex, PFC）发育过程中出现的人类特异性分子程序。研究背景在于，相较非人灵长类，人脑不仅体积更大、皮层区间联结更复杂，而且具有更长的发育时间窗，尤其在婴儿期经历显著的胶质发生、突触发生和髓鞘化过程。既往研究已较充分描述成人脑中的人类特异性转录组和表观基因组变化，但对于晚胎儿期至出生后早期这一关键发育阶段，受限于类人猿组织样本极度稀缺以及体外培养模型难以准确覆盖相应时相，相关证据长期不足。由于决定发育进程的关键基因表达程序通常具有严格的时间限制性，因此这一空白严重制约了对人脑演化、语言习得敏感期以及社会化关键阶段的理解。基于这一问题，研究人员系统比较了人类、黑猩猩和恒河猴出生后早期背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC）的单细胞分子特征，以解析人类婴儿特异性的细胞状态、转录网络及其与神经疾病易感性的关联。

研究人员首先构建了跨灵长类婴儿与成人PFC的单核RNA测序（single-nucleus RNA-seq, snRNA-seq）图谱，并进一步结合单细胞多组学分析，对转录调控网络及开放染色质特征进行整合建模。结果显示，婴儿期存在两个富集的细胞状态：一类为婴儿特异性L2/3投射神经元状态，另一类为表达BCAS1的未成熟少突胶质谱系细胞，即承诺型少突胶质前体（committed oligodendrocyte progenitors, COPs）。在此基础上，研究进一步鉴定出人类婴儿特异性的表达变化，发现其在少突胶质谱系中与孤独症谱系障碍（autism spectrum disorder, ASD）相关，在神经元谱系中与帕金森病（PD）相关。更重要的是，这些程序可追溯至一个与人类特异性调控DNA序列改变相耦联的核心网络。研究结论表明，人类婴儿期存在区别于其他灵长类的阶段特异性转录程序，这些程序一方面参与人脑发育特化，另一方面可能构成人类对神经精神疾病和神经退行性疾病特异易感性的发育基础。这项工作的重要意义在于，它将人类早期脑演化与后续疾病风险联系起来，提供了此前难以获得的跨物种婴儿期脑分子证据。

在方法上，研究主要采用以下关键技术路径：其一，收集人类、黑猩猩和恒河猴出生后早期及成人DLPFC样本，其中人类样本来自Netherlands Brain Bank与NIH Human Brain Collection Core，灵长类样本来自Biomedical Primate Research Centre；其二，进行snRNA-seq以解析细胞类型组成及跨物种差异表达；其三，采用单细胞多组学（single-cell multiome，联合RNA与scATAC-seq）刻画开放染色质与转录调控关系；其四，利用BBKNN进行跨批次/跨物种整合，应用SCENIC+推断转录因子（transcription factor, TF）—调控元件—靶基因调控子（regulon）；其五，借助LIANA框架推断配体-受体（ligand-receptor, LR）细胞通讯；其六，将演化差异表达结果与ASD、PD患者单核转录组数据及疾病风险基因集进行交叉分析。

研究结果如下。

Single-nucleus RNA sequencing of the postnatal chimpanzee, human, and macaque prefrontal cortex
研究人员对人类婴儿、黑猩猩婴儿、恒河猴婴儿以及部分成人DLPFC样本进行了snRNA-seq，最终获得37,994个高质量细胞核，并在扩展整合数据集中达到499,245个细胞核。聚类结果显示，三种灵长类在主要细胞类型上总体保守，包括抑制性神经元、兴奋性投射神经元以及多类非神经元细胞。非神经元细胞中进一步识别出少突胶质祖细胞（oligodendrocyte progenitor cells, OPCs）、成熟少突胶质细胞和COPs等亚群，为比较婴儿期跨物种细胞状态奠定基础。

Characterization of infant-enriched immature cell types
研究在婴儿样本中发现两个显著富集的细胞群。其一是仅在婴儿期观察到的L2/3-IS神经元状态，具有CUX2阳性和MEIS2表达特征，相关基因涉及神经分化、神经投射和轴突导向。其二是表达BCAS1的COPs，这类细胞在婴儿样本中数量较多，便于稳健比较。与OPCs和成熟少突胶质细胞相比，COPs富集与突触周围空间、胶质投射及神经突导向相关的基因，并高表达TMEM108，提示其可能参与髓鞘化时序调控和神经精神疾病相关过程。

Temporal dynamics of infant-enriched cell types during human development
通过整合106例人类个体、跨产前至成年阶段的单细胞数据，研究人员追踪了两类婴儿富集细胞状态的时间动态。结果显示，COPs在宫内逐渐增加，于出生后第一年达到峰值，随后在青春期至成年显著下降。L2/3-IS神经元仅在出生后第一年能与其他L2/3神经元明确区分，而在妊娠晚期更接近祖细胞状态。该结果说明，这两种细胞状态是婴儿早期具有明确时间窗口的发育特征。

Primate conserved patterns of intercellular communication in the postnatal DLPFC
借助LIANA框架，研究分析了灵长类婴儿PFC中的细胞通讯模式。结果发现，L2/3-IS细胞可接收来自胶质祖细胞的WNT3-FZD3_LRP6信号以及来自L2/3神经元的WNT10B信号。相比之下，COPs是BMP2、BMP4、BMP8A等骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）配体的强信号发送者，并表达BMP信号调节因子BMPER。最强预测互作是COPs向L2/3-IS细胞经ACVR2A_BMPR1B复合体传递BMP信号。该结果表明，婴儿富集细胞状态之间存在由BMP和Wnt通路介导的复杂互作。

Multiomic characterization of infant-enriched COPs and L2/3 subtypes
研究进一步在黑猩猩和人类婴儿样本中实施联合RNA/scATAC多组学分析，并采用SCENIC+构建保守TF—调控元件—靶基因网络。结果识别出186个高可信度调控子，其中L2/3-IS状态与含MEIS2结合位点的开放染色质高度相关，MEIS2、ZNF595、NEUROD2构成其关键调控模块。COPs则表现出介于OPCs与成熟少突胶质细胞之间的中间型调控图谱，特异激活调控子包括SMAD2、LCORL、SOX4和SOX10，同时伴随SMAD3等抑制型调控子动态变化。这些结果支持COP状态受到BMP信号自调控维持。

Identification of human-specific transcriptional divergence in the postnatal DLPFC
在整合婴儿与成人、三种灵长类的大规模单核数据后，研究分别对婴儿和成人进行差异表达分析。结果在婴儿样本中检出大量人类特异性表达升高与降低事件，其中12,908项被定义为人类婴儿特异性差异表达（human infant–specific DE, hiDE）。约20%至50%的变化具有细胞类型特异性，提示人类演化中的表达改变在婴儿PFC内呈现显著的细胞分辨率特征。研究还通过个体间变异、死亡后间隔（postmortem interval, PMI）及年龄范围扩展分析，验证了这些结果的稳健性。

Human infant–specific expression changes converge on immature OLs and synaptic development
对hiDE基因进行功能富集分析后，研究发现COPs与OPCs共享的人类婴儿特异性表达升高富集于突触定位和突触密度相关基因，而COPs中特异升高的基因还额外富集于迁移、轴突导向和凋亡正调控过程。进一步结合细胞通讯分析，研究显示人类婴儿而非黑猩猩婴儿的COPs和OPCs具有增强的neurexin-neuroligin信号输出，作用对象包括多种神经元亚型；同时，COPs与OPCs间还存在增强的TNFA-ERBB4信号。该结果提示，人类婴儿期演化变化在未成熟少突胶质细胞层面汇聚，并与突触发育密切相关。

Human infant–specific gene expression gains in immature OLs are enriched in both ASD risk genes and gene expression losses in patients with ASD
疾病关联分析显示，少突胶质谱系中的人类婴儿特异性表达升高，尤其在OPCs和COPs中，显著富集ASD风险基因；这一现象既不见于黑猩猩婴儿特异变化，也不见于人类成人特异变化。进一步与ASD患者PFC单核转录组数据交叉后发现，COPs和OPCs中的人类婴儿特异性上调基因，显著对应于ASD患者中下调的基因。基于这些重叠基因的LIANA分析进一步表明，大多数显著LR互作的来源或靶点都涉及COPs，且主要表现为人类婴儿中增强、而在ASD中减弱的信号。该结果支持：人类婴儿期少突胶质谱系中新近演化形成的分子程序，与ASD的分子病理具有时间受限的关联。

Human infant–specific gene expression gains in neurons are enriched in PD risk genes and in genes dysregulated in patients with PD
在神经元谱系中，人类婴儿特异性表达升高显著富集PD风险基因，这种富集未见于人类成人特异变化，也未见于黑猩猩特异变化。与PD患者黑质（substantia nigra）单核转录组交叉后，研究发现神经元中大量重叠基因属于人类婴儿特异性上调，并且既对应PD中的上调，也对应PD中的下调改变。发育轨迹分析表明，这些基因模块在产前晚期和出生后早期富集，随后在成年逐步降低。功能上，相关基因富集于TAU激酶活性正调控等过程，包括HSP90AA1、HSP90AB1等分子伴侣以及SYN3等神经发生/轴突发生相关基因，提示婴儿期轴突与突触发育程序可能与后期PD易感性相关。

A core human infant network that lacks lineage specificity regulates gene sets enriched for ASD-deregulated genes in OLs and PD-deregulated genes in neurons
为解释这些演化变化的潜在驱动机制，研究人员构建了hiDE核心网络（hiDECORE），即将hiDE表达升高节点与开放染色质区域中人类特异性插入（human-specific insertions, hINSs）、缺失（human-specific deletions, hDELs）和人类加速区域（human accelerated regions, HARs）相连接的TF/基因网络。该网络经capture Hi-C数据验证后显示较高一致性。出人意料的是，hiDECORE在少突胶质谱系与神经元谱系之间具有较高重叠，明显不同于通常具有强细胞类型特异性的演化差异表达基因。然而，这一共享核心网络在不同谱系中的疾病关联输出不同：少突胶质谱系中的下游靶基因显著富集于ASD失调基因，而神经元谱系中的下游靶基因显著富集于PD失调基因。NFIB、TCF12等TF被识别为重要节点，提示同一人类婴儿期核心调控网络可在不同细胞谱系中表现出不同疾病相关后果。

讨论部分指出，本研究利用极其罕见的婴儿黑猩猩样本，首次在出生后早期灵长类前额叶中描绘了具有演化意义的单细胞分子图谱。尽管样本量小、跨物种发育状态精确匹配和皮层区域同源性界定仍存在局限，但研究仍稳健识别出婴儿期L2/3-IS神经元和BCAS1⁺ COPs等关键状态。研究认为，COPs在灵长类婴儿脑中不仅是髓鞘化过渡状态，还可能通过BMP信号和突触相关分子参与支持性功能；在人类中，这种状态可能更稳定，从而与髓鞘化延迟和幼态持续有关。进一步地，研究将人类婴儿期少突胶质谱系演化程序与ASD联系起来，将神经元谱系演化程序与PD联系起来，并提出一个含有人类特异性调控DNA改变的共享核心网络，可能同时塑造不同谱系中的疾病易感性。由于该网络在ASD和PD之间提供了共同生物学联系，因此也为两者潜在关联提供了新线索。

研究结论部分可概括为：本研究揭示了人类婴儿期前额叶皮层中存在阶段特异性的人类特异性转录程序，其中未成熟少突胶质细胞相关程序与ASD风险及患者表达改变相关，神经谱系相关程序与PD风险及患者表达改变相关；这些程序共同嵌入一个包含人类特异性调控DNA序列改变、且缺乏谱系特异性的核心转录网络中。该发现加深了对人类早期脑演化及人类特异性神经疾病易感倾向的理解。