编辑推荐：
理解基因型与表型之间的关系对于生物研究的多项领域以及合成细胞的开发至关重要。研究人员描述了一种基于图像的筛选和分选工作流程，用于探索非克隆群体中基因表达囊泡的表型并选择所需变体。研究人员利用自动共聚焦显微镜和实时神经网络辅助图像分析，证明了可以选择具有特定荧光
理解基因型与表型之间的关系对于生物研究的多项领域以及合成细胞的开发至关重要。研究人员描述了一种基于图像的筛选和分选工作流程，用于探索非克隆群体中基因表达囊泡的表型并选择所需变体。研究人员利用自动共聚焦显微镜和实时神经网络辅助图像分析，证明了可以选择具有特定荧光强度、蛋白定位、膜形态和动态行为的脂质体，并将其表型与遗传内容联系起来。这种方法可以显著加速最小合成背景下细胞功能的进化。
在构建完整合成细胞的研究领域中，脂质体中基本细胞功能的模块重建奠定了基础，例如DNA复制、转录翻译、磷脂合成及膜重塑等已在脂质体中重建。传统的功能评估常依赖于荧光显微镜技术，但针对由基因表达程序引导的脂质体表型，传统的体外进化方法在将特定表型链接至其基因型以实现序列-功能映射方面面临挑战。虽然流式细胞分选（FACS）可用于混合基因筛选，但其依赖的一维参数限制了对简单属性的选择。尽管基于图像的高通量分选技术在细胞研究中取得了进展，但其存在设备普及率低、空间分辨率有限、荧光通道少、无法获取时间 lapse 或三维图像以及流动可能影响表型等缺点。因此，开展这项研究旨在建立一种能够同时评估脂质体形态、时空蛋白组织及动态行为的高分辨率、高时空分辨率的筛选分选方法，以加速合成细胞的构建。
研究人员开发了一种基于共聚焦显微镜的方法，通过选择性光激活标记具有所需特性的基因表达脂质体变体，随后通过FACS进行分离，并通过定量聚合酶链式反应（qPCR）或DNA测序确定功能变体的富集情况。该研究采用了无细胞转录翻译系统（PURE系统）与DNA模板共封装于脂质体中以启动基因表达，并封装光激活mCherry变体PAmCherry2作为分选标记。图像获取、多模态图像分析及靶向脂质体的刺激通过训练好的神经网络和预定义参数完全自动化。研究样本主要来源于人工制备的含有不同DNA模板库和PURE系统的脂质体混合物，包括用于验证的单一基因表达脂质体、模拟双基因混合库、表达Min蛋白系统的脂质体以及MinD突变体库。
研究结果首先建立了基于图像的脂质体分选流程，验证了共封装PAmCherry2与基因表达兼容性，并优化了405-nm光激发的激光功率以最大化靶标激活并最小化非靶标激活。结果显示，该方法以100%的精确度从模拟库中富集了黄色荧光蛋白（YFP）表达脂质体，基因富集倍数达39倍。其次，研究人员利用YOLOv7-tiny深度学习模型实现了实时脂质体检测及Min蛋白空间组织的分析，成功筛选出膜定位MinD的脂质体，实现了minD基因的19倍富集。第三，通过视频光激活技术，研究人员利用时间序列图像分析识别了Min蛋白的动态振荡行为，并成功标记具有动态行为的脂质体，验证了该方法在捕捉时空动态表型方面的能力。最后，研究人员从含有膜靶向序列（MTS）突变的MinD变异体库中，成功分离并鉴定出具有膜结合能力的最佳变体（Var1野生型和Var7突变型），证明了该方法可用于从库中隔离和基因分型活性基因变体。
论文发表在《SCIENCE ADVANCES》。讨论部分指出，与传统基于单一维度读数或亲和力的选择方法相比，视觉表型分析允许根据形态和时空蛋白组织对脂质体进行分类。尽管脂质体尺寸小且分散性高，但高数值孔径的共聚焦成像实现了准确的单囊泡光激活。该研究通过整合荧光强度、蛋白共定位、形态及时间维度，实现了对高达70万个脂质体的高效筛选，并从极少数的分选脂质体中成功回收并测序了DNA。研究人员指出，当前方法的回收率受限于FACS对微小脂质体的散射光信号检测，未来可通过优化光激活信号触发记录或改进显微室设计来提高效率。此外，高通量筛选可通过缩短采集、分析或刺激时间来提升，而无监督学习方法的应用有望减少人为偏差，推动合成细胞的开放式进化。研究结论表明，基于显微镜的表型选择作为核心技术人员，结合体外进化策略，为构建具有复杂表型的合成细胞提供了强有力的工具，能够系统地加速合成细胞中功能模块的开发与优化。
