一种无标记电化学适配体传感器能够实现超灵敏且特异性的神经丝蛋白检测

《Biosensors and Bioelectronics》：A Label-free Electrochemical Aptasensor Enables Ultrasensitive and Specific Detection of Neurofilament Light

　　

李航宇|胡秦宇|佩尔采·克里斯蒂娜|马特奥·亚历杭德罗·马丁内斯·罗克|孙胜凯|桑托罗·弗朗切斯卡|奥芬豪瑟·安德烈亚斯|迈尔·迪尔克

于利希研究中心，威廉-约翰恩街52428号，德国于利希

摘要

血浆神经丝轻链（NfL）已被确定为阿尔茨海默病（AD）早期阶段的潜在生物标志物，能够反映临床前阶段的神经轴突退化。然而，其在血液中的浓度极低，这给分析带来了重大挑战。尽管单分子阵列（Simoa）检测方法具有极高的灵敏度，但它们仍然成本高昂、需要复杂的仪器设备，并且难以在分散式环境中实施。在这里，我们报道了使用毛细管电泳-SELEX技术鉴定和设计针对NfL的高亲和力DNA适配体。通过溶液相荧光偏振法评估了候选适配体的结合能力以及适配体截短的效果。分子建模提供了关于适配体-蛋白质相互作用的结构信息，从而支持了适配体设计的合理优化。优化后的截短适配体被集成到微制造的金电极上，构建了电化学适配体传感器，其Kd值为1.67 ± 0.47 nM。为了进一步提高分析性能，这些适配体被应用于离子门控有机电化学晶体管（iOECTs）中，形成了一个超灵敏且高度选择性的平台，能够在0.1 × 人血清浓度下检测到NfL，其检测限低至9 aM。这项工作为基于抗体的检测方法提供了一种可扩展、微创且成本效益高的替代方案，并为早期神经退行性疾病的诊断提供了一种多功能的生物传感策略。

引言

阿尔茨海默病（AD）是导致痴呆的最常见原因，影响了全球大量人口。这是一种进行性的神经退行性疾病，其特征是症状在数年内逐渐出现并恶化。（Porsteinsson等人，2021；Scheltens等人，2016）AD的核心病理生物标志物——淀粉样蛋白-β（Aβ）和过度磷酸化的tau蛋白（p-tau）可以在临床症状出现前几十年就被检测到，其浓度会随时间稳步增加。这些早期生物标志物的存在为识别有轻度认知障碍（MCI）高风险个体提供了宝贵的机会。（Porsteinsson等人，2021）通过正电子发射断层扫描（PET）可以观察到脑脊液（CSF）中Aβ42或Aβ42 : Aβ40和tau蛋白浓度的变化。（Frisoni等人，2017）然而，PET成像需要放射性示踪剂，且成本较高，限制了其在临床实践中的广泛应用。相比之下，基于血液的生物标志物检测方法更具成本效益和可扩展性，使其成为多阶段诊断过程中的首选方法，特别是在初级保健环境中。（Guo等人，2024；Hampel等人，2018；Stevenson-Hoare等人，2023）神经丝轻链（NfL）多肽是一种轴突蛋白，在神经元或轴突损伤后释放到脑间质液中，并通过血脑屏障进入人体血浆，被认为是AD进展过程中特异性神经轴突退化的第一类液体生物标志物（图1A）。（Abdelhak等人，2023；Khalil等人，2018）在临床实践中，血浆NfL水平越来越多地被用作结果指标，突显了其在神经退行性疾病研究中的重要性。（Khalil等人，2024）血液中NfL的水平至少在痴呆诊断前10年就开始发生变化。（Guo等人，2024）将血浆中苏氨酸181位点磷酸化的tau蛋白（P-tau181）与NfL结合使用，可以更准确地预测MCI患者的认知衰退/AD转化情况，其准确性优于Aβ42/Aβ40和CSF生物标志物。（Cullen等人，2021）然而，已经证明血浆NfL的水平在皮摩尔（pM）范围内甚至更低，这给其检测带来了挑战。

自1989年以来，神经科学在NfL的定量测量方面取得了显著进展（第一个NfL定量试剂盒）。（Karlsson等人，1989）前两代定量检测方法——酶联免疫吸附测定法和更灵敏的电化学发光测定法——无法检测到人体血液中的微小疾病相关变化。只有引入光学单分子阵列（Simoa）后，才能够在广泛的浓度范围内可靠地检测到NfL，包括健康个体的血液样本，其浓度约为0.5 pM。（Mattsson等人，2019，2017）然而，Simoa基于抗体，需要使用大型设备，并且由于荧光染料的光谱重叠，检测通量较低（Dong等人，2024；Wu等人，2023），而且这些方法的实施需要高度稀释样本、微阵列分隔、标记以及使用复杂的光学仪器，使得工作流程既昂贵又耗时，限制了其在临床常规使用中的适用性。适配体作为寡核苷酸，被用作适配体传感器的识别单元，被视为化学抗体。与抗体和其他基于蛋白质的亲和试剂不同，它们体积更小（<30 kDa，而IgG抗体约为150 kDa），并且具有更高的化学和热稳定性。（Hu等人，2023a）成本效益高的化学合成方法使得大规模生产成为可能，并且批次间变异性较低。新型适配体的生成通过一种称为SELEX（系统进化配体法）的体外技术实现（图1B）。（Tuerk和Gold，1990）适配体可以应用于不同类型的生物传感器中，例如电化学生物传感器，在这些传感器中，它们已经显示出有助于疾病的早期诊断、疾病进展的监测以及个性化治疗计划的制定。（Ye等人，2024a，2024b）

然而，当将电化学传感器概念转化为微电极以实现快速动力学、检测微量分析物浓度或实现传感器阵列时，电极的小尺寸会导致传感器电流（信号）较小。最近，报道了使用离子门控有机电化学晶体管（iOECTs）来现场放大适配体传感器信号。这些换能器可以微制造，直接暴露在含有分析物的介质中，并使用离子可渗透的共轭聚合物作为通道。利用电解质中的离子渗透效应实现门控，而不是像场效应晶体管（FET）那样通过绝缘介质进行场驱动的门控。（Xiang等人，2021）当在电解质上施加负/正门控场时，阴离子/阳离子会向这些离子掺杂的通道迁移。为了将门控效应与传感器应用联系起来，门电极通过含有自组装单层（SAM）的适配体进行功能化。门电极的电容（CG-E）与通道电容（CH-E）的耦合可以有效地调节通道电流（Id），从而放大传感器信号。当CG-E占主导地位时，门和通道之间的电压主要通过通道/电解质界面（VCH-E）传递，即使门电容发生微小变化也会导致Id的大幅调节，使得iOECTs成为强大的生物传感器。（Spyropoulos等人，2019）最近，除了这里介绍的适配体外，还有竞争性SELEX衍生的NfL适配体MN711和MN734被报道能够以纳摩尔亲和力结合NfL，并在人血浆中保持可检测的结合能力，其Kd值分别为11 nM和8.1 nM。（Mayer等人，2026；Matsumoto等人，2026）

为了检测超低浓度的NfL并解决当前临床检测方法的局限性，我们通过将适配体选择与iOECT技术相结合，建立了一种全面的适配体传感器开发策略。通过系统筛选和高通量测序，我们鉴定出了对NfL具有高亲和力和特异性的适配体（图1B），计算建模提供了它们在生理条件下的稳定结合模式的见解。选定的适配体随后被功能化并应用于光学（图1C）和电化学检测（图1D）中，显示出它们的广泛应用性。利用光刻技术，我们制造了紧凑轻便的iOECT芯片，在门电极界面处的适配体-蛋白质相互作用引发了构象变化，这些变化通过门/电解质/通道界面耦合转化为电信号。这种方法能够放大由结合事件引起的电信号，即使在复杂的生物环境中也能确保稳健和超灵敏的信号读取（图1E，F）。

章节片段

CE和HT-SELEX促进适配体候选物的发现

正如一项使用不同库长度的比较研究所示，从短随机序列库中选出的适配体在结构和功能上严重依赖于引物结合位点，这与从长库池中开发的适配体不同。（Lozupone等人，2003）引物的不成比例长度（约18个核苷酸）和短随机区域（≤ 20个核苷酸）对SELEX结果产生了重大影响，而较长的随机区域则允许筛选更长的结合基序和更结构化的适配体。

结论

虽然在临床浓度下检测阿尔茨海默病生物标志物神经丝轻链（NfL）一直是护理点诊断的一个难以实现的目标，但这项工作在NfL生物传感方面取得了重大进展。我们设计了一种新型电化学适配体传感器，结合了高亲和力结合剂的识别能力和有机电化学晶体管的高放大能力。通过有效的CE-SELEX/HT-SELEX工作流程，我们鉴定出了高性能的适配体。

CRediT作者贡献声明

迪尔克·迈尔：撰写——审稿与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、研究、资金获取、正式分析、概念化。孙胜凯：撰写——审稿与编辑、研究、正式分析。马特奥·亚历杭德罗·马丁内斯·罗克：撰写——审稿与编辑、研究、正式分析。安德烈亚斯·奥芬豪瑟：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理、资金获取，

利益冲突

作者声明没有利益冲突

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

设备是在于利希研究中心的赫尔姆霍兹纳米设施（HNF）制造的。李航宇感谢中国国家留学基金委（202106340041）的财政支持。我们感谢李书颖在编码和对接数据处理方面提供的技术支持。我们感谢HADDOCK网络服务器以及PLIP-Dresden在分子对接和对接后相互作用分析方面的支持。图表使用BioRender.com创建，包括图1A–e和图2