低能激光通过AMPK介导的自噬缓解顺铂诱导的PC12细胞氧化应激与凋亡

《ACS Omega》：Low-Level Laser Mitigates Cisplatin-Induced Oxidative Stress and Apoptosis via AMPK-Mediated Autophagy in PC12 Cells

　　

顺铂等铂类化疗药物是现代抗癌治疗方案的基石。尽管临床疗效显著，但长期应用常受限于剂量相关的副作用，特别是周围神经病变，严重影响患者生活质量并限制治疗成功率，目前神经保护策略仍然有限。低能激光（LLL）疗法，亦称光生物调节作用，近期因其作为一种能减轻包括神经损伤在内的多种组织损伤的非侵入性方法而获得认可，但其对化疗诱导的神经毒性保护作用背后的细胞和分子机制尚不完全清楚。本研究在PC12神经元细胞体外模型中考察了LLL对顺铂毒性的神经保护作用。PC12神经元细胞在暴露于10 μM顺铂24小时前，先接受660 nm、5 J/cm2、10 min的LLL照射预处理。通过MTT和乳酸脱氢酶（LDH）测定评估细胞活力和细胞毒性；通过TUNEL染色和caspase-3活性评估凋亡；通过JC-1染色评估膜电位，MitoSOX评估线粒体活性氧（ROS），丙二醛（MDA）测定评估脂质过氧化，以检查线粒体功能和氧化应激。使用小干扰RNA（siRNA）沉默AMPK表达，并通过Western blot分析自噬、凋亡和AMPK信号相关的蛋白水平。结果表明，5 J/cm2的LLL预处理显著提高了细胞活力，降低了10 μM顺铂诱导的细胞毒性和凋亡。LLL减少了顺铂引起的氧化应激并维持了线粒体功能，表现为较低的脂质过氧化、减少的线粒体ROS产生和稳定的线粒体膜电位。此外，发现这些保护作用是通过激活AMPK信号通路介导的，该通路增强了自噬并抑制了凋亡过程。AMPK的沉默消除了LLL的神经保护作用，证实了其在这一机制中的关键作用。总体而言，研究结果提示LLL疗法通过AMPK驱动的自噬对顺铂诱导的神经元损伤表现出强大的神经保护作用，为管理化疗诱导的周围神经病变提供了一种有前景的辅助策略。

癌症治疗的进步使得癌症幸存者群体日益庞大，化疗相关的毒性已成为重要的研究领域。顺铂作为一种广泛使用的铂类化疗药物，虽然能有效治疗多种恶性肿瘤，但其不良反应，特别是周围神经毒性，常导致剂量降低或治疗中断，严重影响患者生存质量。顺铂诱导的周围神经病变表现为感觉异常，如麻木、刺痛等，且可能持续存在甚至恶化。其机制涉及氧化应激、线粒体功能障碍和凋亡，但确切机制尚不完全明确。低能激光（LLL）疗法作为一种非侵入性治疗手段，已在临床上用于促进伤口愈合和缓解炎症疼痛多年，近期在肿瘤学领域也被探索用于管理癌症治疗毒性。尽管有研究表明LLL能改善顺铂诱导的PC12细胞活力下降和凋亡，但其具体神经保护机制及AMPK信号在其中扮演的角色仍需进一步阐明。鉴于AMPK作为主要能量传感器，在调节线粒体功能、自噬和凋亡中起关键作用，且LLL可通过上调AMPK发挥保护作用，本研究旨在评估LLL对顺铂处理的PC12神经元细胞的影响，并探究AMPK信号在其中的作用，为未来临床应用奠定基础。该研究结果发表于《ACS Omega》。

为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：使用 rat pheochromocytoma（PC12）神经元细胞作为研究模型；通过低能激光（波长660 nm，能量密度5 J/cm2）进行照射处理；使用顺铂诱导细胞毒性；利用MTT和乳酸脱氢酶（LDH）测定评估细胞活力与毒性；通过TUNEL染色和caspase-3活性检测凋亡；运用JC-1染色、MitoSOX荧光探针及丙二醛（MDA）测定评估线粒体功能与氧化应激水平；采用小干扰RNA（siRNA）技术沉默AMPK表达以验证其功能；并通过Western blot技术检测AMPK信号通路、自噬相关蛋白（如Beclin-1, LC3, p62）及凋亡相关蛋白的表达水平。

在研究结果方面，首先，LLL照射改善了顺铂诱导的神经毒性。数据显示，5 J/cm2剂量的LLL照射显著增强了顺铂处理后的PC12细胞存活率，降低了细胞毒性（LDH释放减少），并通过TUNEL流式细胞术分析发现LLL显著减少了顺铂诱导的凋亡。其次，LLL通过激活AMPK/ACC信号通路促进自噬。研究发现，LLL照射增加了PC12细胞中AMPK的磷酸化水平，并进一步增强了顺铂引起的AMPK磷酸化。同时，AMPK的底物ACC也被磷酸化，表明AMPK被激活。此外，LLL增强了顺铂诱导的自噬标志物Beclin-1和LC3-I/II的表达，并降低了p62的水平，而当AMPK被沉默时，这些效应消失，证明LLL通过AMPK-ACC通路增强自噬。第三，LLL通过调节AMPK介导的自噬减轻顺铂引起的氧化应激和线粒体损伤。结果显示，LLL处理阻断了顺铂引起的MDA水平升高和线粒体超氧化物增加。当AMPK被抑制或使用自噬抑制剂氯喹（chloroquine）处理时，LLL的保护作用消失；而当使用rapamycin诱导自噬时，保护作用重现。JC-1染色显示，LLL缓解了顺铂引起的线粒体膜电位去极化，该作用同样依赖于AMPK和自噬的完整性。最后，LLL通过调节AMPK介导的自噬和减少线粒体氧化应激来减轻顺铂诱导的凋亡。研究发现，顺铂导致p53、Bax和细胞色素c水平升高及Bcl-2降低，而LLL逆转了这些变化，且AMPK沉默抵消了该效应。TUNEL和caspase-3活性检测也证实，AMPK缺失或自噬抑制削弱了LLL的抗凋亡作用，进一步表明AMPK介导的自噬对于减轻氧化应激和抑制凋亡至关重要。

在讨论部分，研究人员指出顺铂引起的神经毒性机制复杂，涉及线粒体DNA损伤、氧化应激积累和凋亡启动。本研究结果表明，LLL治疗可通过上调AMPK介导的自噬来减轻顺铂相关的毒性。自噬作为清除受损细胞器和蛋白的重要机制，其激活有助于维持细胞稳态。研究证实顺铂可诱导AMPK介导的自噬，而LLL进一步增强了这一过程，从而减少线粒体功能障碍和氧化应激，改善神经病变。线粒体功能对于ROS生成和钙稳态至关重要，顺铂引起的线粒体损伤导致ROS增加和细胞色素c释放，进而启动凋亡。LLL通过AMPK介导的自噬清除受损线粒体，减少氧化应激，从而抑制凋亡通路。综上所述，研究结论为LLL疗法在顺铂诱导的神经病变中的神经保护作用提供了机制基础，表明其作为一种辅助治疗策略，可通过调节AMPK自噬轴来缓解化疗毒性，具有潜在的临床应用价值。