高分辨率MALDI-MSI与拉曼成像自动配准技术在法布雷病小鼠模型心脏组织中的应用

《Analytical Chemistry》：Automatic Coregistration of High-Resolution MALDI-MSI and Raman Imaging Applied to Cardiac Tissue of Fabry Disease Mouse Models

　　

早期识别生物组织中的分子变化对于病理性和遗传性疾病的诊断及其潜在机制的阐明至关重要。然而，低分子量化合物（<2000 Da）的局部分子改变无法通过常规染色或遗传学方法推断。在这项研究中，研究人员建立了一种多模态成像方法，将拉曼光谱与大气压基质辅助激光解吸电离质谱成像（AP-MALDI-MSI）相结合，实现了对法布雷病（FD）小鼠模型心脏组织的高分辨率分析。研究采用三种基因型小鼠：野生型（GLA^WT）、半合子α-半乳糖苷酶A基因敲除（GLA^KO）以及敲除联合人Gb3合酶表达的G3Stg/GLA^KO小鼠。研究人员首先通过25 μm步长的AP-MALDI-MSI检测Gb3积累，随后采用5 × 5 μm²像素分辨率的高分辨率AP-MALDI-MSI揭示Gb3分子亚型的异质性空间分布。同时，2 μm像素分辨率的拉曼成像通过层级聚类分析（HCA）和多曲线分辨-交替最小二乘法（MCR-ALS）解析了核酸、脂质、蛋白质和胶原等化学成分。研究人员开发了基于Python的自动化图像配准算法，利用明场（BF）图像中的红色标记点，通过快速归一化互相关算法和边缘检测神经网络实现两种模态的微米级配准，配准精度达（5.1 ± 1.6）μm。该工作流成功将AP-MALDI-MSI的Gb3特异性检测与拉曼成像的组织结构表征相结合，为法布雷病心脏组织的分子异质性研究提供了新的分析工具。

研究背景与意义

法布雷病（FD）是一种X染色体连锁的溶酶体贮积症，由编码α-半乳糖苷酶A（GLA）的基因致病性变异引起，导致其主要底物球三糖神经酰胺（Gb3）在多种细胞类型中异常积累。该疾病呈现高度异质性的多系统临床表现，从多器官受累到以心脏或神经系统为主的 selective involvement，其表型变异受性别、基因型、年龄及未知遗传修饰因子等多种因素影响。尽管目前已有基因检测以及血液lyso-Gb3和Gb3水平的测定方法，但Gb3的个体化和异质性沉积模式使得推断肾脏、脑或心脏损伤的特定风险以及确定个体化最优治疗策略仍面临挑战。传统诊断流程依赖于形态学、靶向免疫组织化学或生化检测，这些方法缺乏对不同化学类别生物分子尤其是低分子量化合物（<2000 Da）的全面覆盖，无法捕捉影响疾病发生发展的局部微环境信息。

振动光谱方法如中红外光谱和拉曼光谱、相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）及受激拉曼散射（SRS）光谱在探究健康和疾病组织的无靶向局部生物分子变化方面显示出潜力。拉曼光谱基于可见光或近红外光的非弹性散射，具有高度的化学特异性和约400 nm的空间分辨率，能够实现脂质、蛋白质等生化组分的详细 mapping。然而，这些技术对低浓度或空间异质性分布的内源性化合物的分子身份鉴定仍存在困难。另一方面，基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI-MSI）虽能提供多种生物分子的详细空间分辨信息，但其像素分辨率通常限于5–25 μm，且某些化合物类别如蛋白质的检测存在技术困难。尽管高级实验装置如AP-SMALDI或透射模式MALDI结合激光后电离和等离子体后电离可实现约1–2 μm的像素分辨率，但这些方法操作复杂度高，需在信号强度和像素分辨率之间进行权衡。因此，将MSI的分子注释能力与拉曼成像的高横向分辨率及化合物类别特异性相结合，构建能够最大化单张组织切片信息获取并最小化分析缺陷的生物分析工作流，成为该领域的迫切需求。

已有概念验证研究表明拉曼成像和MSI应用于生物组织时可提供互补信息，但这些研究并非总能实现选择性感兴趣区域（ROIs）的自动 alignment，尤其是在ROIs缺乏全局对齐点的情况下。低像素尺寸图像与小ROI记录的配准因缺乏单个消融标记而尤为困难。针对上述挑战，研究人员开展了本项研究。

关键技术与方法

研究人员所用样本为18–20周龄C57BL/6J遗传背景的雄性小鼠，包括GLA^WT野生型、GLA^KO敲除型和G3Stg/GLA^KO转基因三种基因型。组织切片采用20 μm厚度冷冻切片制备，分别置于CaF₂载玻片或显微玻片上。拉曼成像使用alpha 300R共聚焦拉曼显微镜，785 nm激发激光，50×/0.75 NA干式物镜，100 mW功率，2 s积分时间，2 μm像素分辨率，300线/mm光栅，ROI大小为150–200 μm。数据分析采用HCA结合MCR-ALS方法，使用pymcr 0.5.1包和scikit-learn包。AP-MALDI-MSI使用Q Exactive HF轨道阱质谱仪配备AP-MALDI（5）AF离子源，全局20%衰减器和38°可变衰减器，正离子模式采集，25 μm测量质荷比范围m/z 200–2000，5 μm测量m/z 500–1500，分辨率240,000。数据处理使用LipostarMSI v2.1.0b7和Metaspace平台进行脂质注释，RMS归一化和热图均衡化 hotspot去除。自动配准采用自主开发的Python 3.12应用程序，利用OpenCV和scikit-image 0.25.2包，通过快速归一化互相关算法进行模式匹配，以 holistically nested edge-detection神经网络进行边缘检测，Otsu阈值法提取红色标记点，cv2.estimateAffinePartial函数计算仿射变换矩阵，最终实现微米级配准。

研究结果

AP-MALDI-MSI检测Gb3积累

研究人员首先通过25 μm步长的AP-MALDI-MSI评估了三种基因型小鼠心脏组织中Gb3的检测能力。结果显示，G3Stg/GLA^KO小鼠心脏组织中Gb3积累显著高于GLA^KO样本，而GLA^WT对照组织中Gb3信号缺失。通过AP-MALDI-MSI，研究人员在G3Stg/GLA^KO样本中检测到并注释了12种Gb3亚型，在GLA^KO样本中检测到9种，GLA^WT样本中未检测到Gb3。液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）验证确认了AP-MALDI-MSI注释的分子身份。统计结果表明，Gb3（34:1）和Gb3（42:2）等Gb3化合物在G3Stg/GLA^KO组心肌中相对于GLA^KO组显著上调。该部分结果证实了法布雷病小鼠模型中Gb3的积累，并展示了优化AP-MALDI-MSI方法可视化最丰富Gb3分子亚型分布的能力。

Gb3亚型异质性沉积的确定

研究人员进一步通过5 × 5 μm²像素分辨率的高分辨率AP-MALDI-MSI揭示了Gb3在心肌组织中的异质性分布。结果显示，Gb3积累呈现局部化强度斑点，不同Gb3分子亚型表现出差异性的空间定位模式。例如，Gb3（42:2）在某些区域显著积累，而Gb3（38:1）在这些区域信号较低，在组织其他区域信号增强。与高分辨率明场图像和H&E染色图像的比较表明，这些Gb3积累区域局限于单个或少数相邻细胞。值得注意的是，25 μm和5 μm空间分辨率测量中的主要分子加合物从钾离子（K⁺）加合物转变为钠离子（Na⁺）加合物，这归因于5 μm测量前应用的4%多聚甲醛（PFA）固定程序，但该固定过程不影响检测到的Gb3 species总数。

法布雷病小鼠模型心脏组织的拉曼成像

研究人员对三种基因型小鼠心脏切片进行了拉曼成像分析。HCA分析中，10个聚类的设置允许区分DNA/RNA积累（与细胞核或线粒体相关）和组织基质。"组织"聚类特征为1003 cm^?1（苯丙氨酸）、1255 cm^?1（酰胺III带）和1445 cm^?1（CH₂/CH₃伸缩振动）处的拉曼强度峰；DNA/RNA（"细胞核"）聚类特征为785 cm^?1和1095 cm^?1处的DNA骨架和核酸特征峰。将聚类数量增加至100时，研究人员识别出特征峰位于1061 cm^?1、1125 cm^?1和1297 cm^?1的两个额外聚类，这些峰与商业Gb3提取物的特征强度峰相关，但Gb3聚类仅在少数像素中出现。

通过MCR-ALS分析，研究人员提取了四种主要化学成分： "细胞核"成分显示均匀分布的DNA斑点；"组织"成分显示基于脂质/蛋白质比率的组织形态结构；"胶原"成分（858 cm^?1、947 cm^?1和1240 cm^?1处的强度峰）；"脂质"成分（1064 cm^?1和1127 cm^?1处的νC–C区域峰、1265 cm^?1处的＝CH峰、1295 cm^?1处的CH₂峰和1439 cm^?1处的CH₂/CH₃峰）。脂质成分在G3Stg/GLA^KO组织中的丰度显著高于GLA^KO和GLA^WT小鼠，而GLA^KO与GLA^WT组之间仅观察到平均脂质含量的增加但无显著差异。

小鼠心脏组织AP-MALDI-MSI与拉曼成像的自动配准

研究人员开发了自动化配准软件应用程序，整合拉曼成像和AP-MALDI-MSI数据。该过程包括三个关键步骤：将拉曼成像结果定位于拉曼相关明场图像中；将AP-MALDI-MSI测量定位于MALDI相关明场图像中；配准拉曼和MALDI相关的明场图像。通过计算交并比（IoU）评估定位准确性，AP-MALDI-MSI和拉曼成像的IoU分数分别为0.985和0.991。通过测量两幅明场图像中参考点之间的距离评估自动配准性能，实现了（5.1 ± 1.6）μm的配准精度。配准结果显示，拉曼测量位置（小红方块）可与AP-MALDI-MSI的Gb3（34:1）概览图像叠加；PC（34:1）的分布与拉曼脂质组分分布验证了一致性；Gb3分布与拉曼成像的组织成分（绿色）和核酸成分（蓝色）整合，展示了两种技术的互补分析能力。

讨论与研究结论

研究人员建立了一种在微米尺度整合AP-MALDI-MSI和拉曼光谱的生物分析流程。尽管此前已有研究结合拉曼和MSI技术，但本研究首次实现了5 μm像素大小的MSI数据与2 μm像素大小的拉曼显微镜数据在转基因小鼠模型中的配准。两种方法独立捕捉了Gb3和脂质积累的显著变化，5 μm-AP-MALDI-MSI与拉曼光谱的结合揭示了Gb3积累的空间异质性景观。

在GLA^KO和G3Stg/GLA^KO法布雷病小鼠模型中， previous reports已通过荧光显微镜观察到Gb3在心脏成纤维细胞的溶酶体中积累及随后的溶酶体破裂。本研究开发的多模态拉曼/AP-MALDI-MSI工作流为心脏组织中Gb3积累提供了更高的分子分辨率，揭示了Gb3聚集不仅在组织上呈异质性分布，而且表现出可变的脂质组学组成，这一不同Gb3亚型间的额外异质性层次无法通过荧光显微镜方法获取。约5 μm精度的AP-MALDI-MSI、拉曼成像和明场显微镜数据自动配准实现了Gb3积累的组织背景化。

研究人员指出，AP-MALDI-MSI揭示了迄今为止通过显微镜方法未能检测到的Gb3在心脏组织中的局部异质性调控，而拉曼成像在此研究中提供了组织背景但未揭示组织结构或分子调控的新见解。该工作流未来将扩展至人体活检材料，以关联不同Gb3分子亚型与患者表型，并评估治疗结局是否与心脏组织中Gb3改变的脂质组学特征相关。除法布雷病外，该流程在拉曼成像可揭示生物分子聚集事件的其他生物医学研究领域也具有潜在应用价值，例如心肌炎微环境分析或心脏组织中饮食依赖性脂质积累的研究。

该论文发表于《Analytical Chemistry》。