乙酸作为流动相添加剂，通过HPLC-MS/MS技术在负离子模式下促进了尿嘧啶修饰物的鉴定和定量分析

《Analytica Chimica Acta》：Acetic Acid as Mobile Phase Additive Facilitated the Identification and Quantification of Uridine Modifications in Negative Ion Mode by HPLC-MS/MS

　　

施克强|廖建聪|孙翠荣|冯洪如|潘远江

中国浙江省杭州市浙江大学化学系，310058

摘要

RNA修饰对所有生物体都至关重要。目前已发现至少63种尿苷修饰类型，占所有报道的RNA修饰中的最大比例。研究表明，尿苷修饰在多种人类疾病中存在异常。然而，众所周知，尿苷修饰的质谱分析受到其低电离效率的限制。在这里，我们开发了一种简单而可靠的方法，可以同时鉴定和定量生物样本中的22种尿苷修饰。实际上，与常用的正离子模式相比，尿苷及其许多修饰在负离子模式下更容易电离。此外，负离子模式下尿苷修饰的碎片化模式可以提供更多的结构信息，而正离子模式下主要观察的是糖苷键的断裂。此外，只需在流动相中加入0.2 mM的醋酸，尿苷及其所有22种修饰的峰面积就可以提高4.1-55.4倍。利用这种新方法，我们分别在293T总RNA、293T小RNA、E. coli tRNA、S. cerevisiae tRNA和小麦胚芽tRNA中定量了16、14、11、12和16种尿苷修饰。这项研究为研究各种生物样本中尿苷修饰的鉴定和定量提供了通用且有效的方法。

引言

RNA是具有重大生物学意义的生物分子。从构建块的角度来看，多种因素导致了它们的化学多样性。例如，RNA修饰[1]、[2]、RNA帽结构[3]、[4]、RNA损伤[5]、[6]、脱氧核苷酸的错误掺入[8]、RNA碱基缺失位点[9]，以及RNA与其他生物大分子（如蛋白质[10]和糖类[11]）之间的共价连接等。其中，已有超过150种天然存在的RNA修饰被报道[1]，并且不断有新的修饰被发现[12]、[13]、[14]。

目前已发现至少63种尿苷修饰[1]、[2]、[13]、[15]、[16]、[17]、[18]，占所有RNA修饰的最高比例，超过了腺苷、鸟苷和胞苷。研究表明，尿苷修饰在多种疾病中存在异常，如线粒体相关疾病和癌症[19]、[20]、[21]。此外，众所周知，1-甲基伪尿苷（m¹Ψ）促进了针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗的快速发展[22]。最近的一项研究表明，3-(3-氨基-3-羧基丙基)尿苷（acp³U）与糖RNA中的N-糖苷共价连接[23]。因此，对尿苷修饰进行敏感的表征既有趣又必要。

质谱分析是全面分析RNA修饰的强大工具。然而，尿苷及其修饰在电喷雾电离中的电离效率较低[24]、[25]，这可能是由于它们的pKa值较低。实际上，已经开发了两种化学衍生化方法，用于在正离子模式下敏感检测几种尿苷修饰[26]、[27]。其中，第一种方法使用N-环己基-N'-β-(4-甲基吗啉基)乙基卡博迪亚胺p-甲苯磺酸盐（CMCT）标记7种尿苷修饰的N³位点[26]；第二种方法使用2-溴-1-(3,4-二甲氧基苯基)-乙酮（BDMOPE）衍生化6种尿苷的硫醇化和羟基化修饰[27]。然而，这些衍生化方法劳动强度大，并且仅限于含有特定功能团的修饰。RNA中的尿苷在不同物种的不同位置被多种功能团修饰[1]、[2]、[13]、[15]、[16]，其中许多修饰在生物样本中尚未被定量。因此，开发一种简单的方法来同时鉴定和定量尽可能多的尿苷修饰是非常重要和必要的。

我们发现，尿苷及其许多修饰在负离子模式下电离效率更高。此外，只需在流动相中加入相对少量的醋酸（0.2 mM，优化值），尿苷及其所有22种修饰的峰面积在负离子模式下可以进一步提高4.1-55.4倍。此外，尿苷及其大多数修饰的串联质谱碎片化模式可以提供更多的结构信息，包括糖苷键断裂、碱基断裂、糖环断裂，以及[M-H]^-离子中的CH₃OH、CO₂或3-氨基-3-羧基丙基（acp）基团的进一步丢失，而这些在正离子模式下主要观察的是糖苷键断裂。

我们的方法成功地在293T总RNA、293T小RNA（< 200 nt）以及来自E. coli、S. cerevisiae和小麦胚芽的商业可用tRNA样本中定量了16、14、11、12和16种尿苷修饰。此外，还检测到了小麦胚芽tRNA中的2-硫尿苷（s²U）、293T小RNA中的5-羧甲基尿苷（cm⁵U和5-羧甲基尿苷（mcm⁵Um），以及S. cerevisiae tRNA中的acp³U，但其含量低于定量限。我们为涉及尿苷修饰分析的其他研究提供了一种有前景的方法。

章节片段

化学品和试剂

尿苷及其22种修饰是从各种商业资源中获得的。这些标准的化学结构和详细信息见支持信息（SI）的图1A和表S1。LC-MS级甲酸（HCOOH）、醋酸（CH₃COOH）和醋酸铵（CH₃COONH₄）购自Fisher Chemical（美国宾夕法尼亚州匹兹堡）。核酸酶P1和南极磷酸酶购自New England Biolabs（美国马萨诸塞州伊普斯威奇）。

流动相中的0.2 mM醋酸有助于在负离子模式下检测尿苷修饰

众所周知，尿苷及其修饰在正离子模式下的电离效率较低[24]、[25]。虽然有少数研究尝试在负离子模式下分析尿苷修饰，但在E. coli中通过LC-MS在负离子模式下定量了ho⁵U[33]，并且在N. equitans和/或I. hospitalis中也鉴定出了Um、m⁵U、Ψ、m¹Ψ、m¹Ψm、s²U、s²Um、m⁵s²U、s⁴U、s⁴Ψ和m¹s⁴Ψ[18]。然而，据我们所知

结论

尿苷及其修饰在LC-MS分析中的电离效率较低。在这里，我们开发了一种简单的LC-MS/MS方法，用于在负离子模式下敏感检测和定量尿苷修饰。只需在流动相中加入0.2 mM的醋酸，尿苷及其22种修饰的峰面积就可以提高4.1-55.4倍。利用这种新方法，我们分别在小麦胚芽tRNA中定量了16、14、11、12和16种尿苷修饰

CRediT作者贡献声明

施克强：撰写——原始草稿、可视化、方法学、研究设计、概念化。廖建聪：撰写——审稿与编辑、数据管理。潘远江：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念化。孙翠荣：撰写——审稿与编辑、资源准备。冯洪如：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资金获取、概念化

本文作者不存在任何利益冲突。

数据可用性

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本工作得到了国家自然科学基金（编号22336004、22522610、22476172）和中央高校基本科研业务费（编号2024BSSXM07）的支持。我们还要感谢浙江大学的化学仪器中心提供的仪器支持。