感染了Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）的Penaeus vannamei鱼肌肉蛋白质组学与神经递质靶标代谢组学的综合分析

《Aquaculture》：Integrated analysis of muscle proteomics and neurotransmitter-targeted metabolomics in Penaeus vannamei infected with Enterocytozoon hepatopenaei (EHP)

　　

尹志鹏|田雅洁|何传宇|杨帆|严东春|李婷|常林瑞|司凌军

鲁东大学渔业学院，中国烟台

摘要

凡纳滨对虾是全球主要的养殖虾类之一，其生长情况是评估其商业价值的关键指标。近年来，由Enterocytozoon hepatopenaei（EHP）引起的肝胰腺微孢子虫病（HPM）在世界各地的虾养殖场中肆虐，严重影响了虾的生长，并给水产养殖业造成了巨大的经济损失。本研究首次采用肌肉蛋白质组学和血浆神经递质靶向代谢组学的联合分析方法，来研究EHP感染对凡纳滨对虾全身性的影响。肌肉蛋白质组学分析发现了199个差异表达蛋白（DEPs），其中127个上调，72个下调。与病原体感染相关的血蓝蛋白亚基L2（HcL2）的表达显著上调，而与免疫和代谢调节相关的磷酸二酯酶（PDE）的表达显著下调。一些差异蛋白也与虾的生长有关，例如表皮生长因子相关蛋白1（EGFrP1）和肌球蛋白重链（MYH）的表达显著上调，表明EHP感染后的虾肌肉组织修复和补偿作用得到了增强。神经递质靶向代谢组学分析显示，EHP感染导致虾的代谢紊乱，表现为L-谷氨酸水平显著下降，3-羟基犬尿氨酸和犬尿氨酸水平显著升高。这表明色氨酸-犬尿氨酸（Trp-Kyn）代谢途径的整体活性增强，而5-羟色胺（5-HT）的合成受到抑制。本研究从神经内分泌学的角度，有助于理解EHP感染导致虾生长抑制的分子机制。

引言

近年来，随着水产养殖业的快速发展，凡纳滨对虾因其高蛋白含量和美味口感而广受欢迎，为养殖户带来了显著的经济价值，逐渐成为世界上最具经济价值的水产物种之一（Cao等人，2023b）。然而，由于高密度和集约化养殖的普及，大量微生物（如病毒和真菌）也得以繁殖，包括白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血组织坏死病毒（IHHNV）以及Enterocytozoon hepatopenaei（EHP），导致了严重的经济损失（Liu等人，2021；Rajeshwar等人，2024；Yang等人，2022）。在各种疾病中，感染EHP的凡纳滨对虾通常表现出生长迟缓，在感染初期没有明显症状，这使得饲料浪费极为严重（Tang等人，2016）。Patil等人（2021）报告称，EHP感染在印度造成的经济损失高达5.6762亿美元，远高于WSSV造成的2.3833亿美元（Patil等人，2021）。因此，深入研究EHP的致病机制并制定有效的预防和控制策略，已成为当前虾养殖业亟需解决的问题。

自2003年泰国首次报告EHP以来，这种病原体已严重影响了虾养殖业（Tourtip等人，2009）。包括中国、韩国、委内瑞拉和东南亚在内的主要虾养殖国家和地区都报告了EHP感染的病例（Kim等人，2022；Tang等人，2017，2016）。此外，我们团队最近的一项调查显示，在从山东省随机选取的639个凡纳滨对虾样本中，EHP的阳性率高达51.2%（Hou等人，2021）。EHP主要寄生在虾的肝胰腺和肠道中（Tangprasittipap等人，2013；Tourtip等人，2009）。这种高度依赖宿主的细胞内寄生虫主要通过夺取宿主的能量和营养物质来繁殖（Wiredu Boakye等人，2017）。许多研究（包括我们团队的研究）表明，EHP感染显著抑制了虾的生长，导致代谢紊乱、免疫防御激活和氧化应激，并伴有肝胰腺和肠道组织损伤（Cao等人，2025，2023a；Sangklai等人，2024；Sathish Kumar等人，2022）。尽管近年来EHP的检测方法越来越高效，但该病原体导致凡纳滨对虾生长缓慢的致病机制尚未得到全面分析（Liu等人，2018a）。EHP寄生如何具体影响凡纳滨对虾的神经内分泌系统仍不清楚。值得注意的是，EHP感染对神经递质释放的影响尚不明确。神经递质在生长调节和病原体防御的信号转导中可能起着关键作用，这可能是阐明其致病机制的重要切入点。

随着组学技术的出现以及转录组学、蛋白质组学和代谢组学的不断创新，探索生物学问题有了新的视角。这些方法已应用于毒理学和生理学等多个领域（Santos等人，2010）。此前，Ning等人（2019）采用蛋白质组学和代谢组学的联合方法，鉴定出参与EHP感染免疫反应的差异表达蛋白，如α2巨球蛋白异构体2、prophenoloxidase激活酶和cathepsin C。此外，EHP感染显著影响了与蜕皮相关的虾幼虫激素酯酶样羧酯酶1和蜕皮激素调节蛋白，能量代谢途径也显著下调（Ning等人，2019）。另外，一项关于自然感染EHP的凡纳滨对虾的肠道微生物组和肝胰腺转录组的报告显示，肠道中有益细菌显著减少，差异表达基因主要与消化、吸收和免疫有关，证实EHP感染影响了营养代谢和免疫功能（Duan等人，2021）。因此，整合不同的组学分析可以更系统地理解生理反应过程，有助于阐明EHP感染导致虾生长迟缓的调节机制。

本研究对凡纳滨对虾进行了人工EHP感染，并检测了病原体载量以确认感染。为了阐明EHP感染期间全身神经内分泌-肌肉调节轴的机制，使用不同类型的组织样本进行了靶向组学分析。利用血浆进行神经递质靶向代谢组学分析，以识别在血淋巴中循环的全身上游信号分子；同时利用肌肉蛋白质组学评估生长迟缓目标组织中的局部下游结构和代谢反应。本研究旨在通过整合肌肉蛋白质组学和神经递质靶向代谢组学，全面分析EHP感染凡纳滨对虾的生理反应机制。研究结果有望为EHP感染导致的虾生长迟缓的调节机制提供新的见解，并为后续的疾病预防和控制策略提供参考。

章节片段

实验动物

实验动物为特定的无病原体（SPF）凡纳滨对虾，来自中国渔业科学院黄海渔业研究所。SPF状态表明这些虾未感染任何主要甲壳类病原体，包括WSSV、IHHNV和EHP等。所有这些病原体均在实验室通过PCR随机检测，确认没有感染。这些虾的平均体长为9.5±1.0厘米

检测虾中的EHP感染

在感染后第10天，NC组的所有样本均检测出EHP阴性。然而，EC组的所有样本均检测出EHP阳性。实时绝对定量PCR结果显示，EC组的EHP拷贝载量最高为1781拷贝/ng DNA，最低为388拷贝/ng DNA，而NC组的拷贝载量为0拷贝/ng DNA（图1）。这些数据表明EC组成功感染了EHP，而NC组未感染EHP

讨论

本研究采用蛋白质组学和代谢组学的联合策略，揭示了EHP感染下凡纳滨对虾肌肉蛋白质组和血浆代谢物的全身性变化。EHP主要感染虾的肝胰腺，可能导致慢性病变、能量代谢受损和显著生长迟缓（Chaijarasphong等人，2021）。先前的研究表明，EHP感染会抑制糖酵解、糖异生和甘油酸氧化

结论

本研究系统阐明了EHP感染导致凡纳滨对虾生长迟缓的神经内分泌肌肉调节机制。结果表明，EHP感染引发了虾的全身免疫应答，表现为免疫因子（如血蓝蛋白）的表达水平升高，以及Trp-Kyn代谢途径的激活。犬尿氨酸和3-羟基犬尿氨酸的上调表明5-羟色胺（5-HT）的合成受到阻断，这起到了重要作用

CRediT作者贡献声明

尹志鹏：撰写——原始草稿、软件、方法学、数据管理、概念构思。田雅洁：撰写——审阅与编辑、数据管理。何传宇：验证、调查。杨帆：调查、数据管理。严东春：可视化、监督、方法学。李婷：软件、方法学。常林瑞：可视化、方法学。司凌军：撰写——审阅与编辑、监督、资源管理、项目协调、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了山东省自然科学基金（ZR2023QC050）的财政支持。