阐明增塑剂DPhP（二苯基邻苯二甲酸酯，diphenyl phthalate）的毒性：来自动物体外（in vitro）至动物体内（in vivo）模型提示其具神经毒性与发育损害作用的证据

《Current Research in Toxicology》：Elucidating the toxicity of the plasticizer DPhP: Evidence of neurotoxicity and developmental impairment from in vitro to in vivo models

　　

作为传统邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）的新兴替代物，二苯基邻苯二甲酸酯（diphenyl phthalate，DPhP）引发日益增多的环境健康关注，但其系统性毒性特征仍知之甚少。研究人员采用人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）及秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）模型研究DPhP暴露的毒性效应及潜在机制。结果显示DPhP显著抑制细胞活力与增殖。机制上，DPhP通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin-dependent kinase inhibitors，CDKIs）（p21和p27）及下调CDK–细胞周期蛋白（cyclin–CDK complexes）复合物，诱导G1/S期细胞周期改变，符合应激诱导的细胞周期进程延迟。在秀丽隐杆线虫中，DPhP暴露损害生长和运动行为。分子分析揭示上述不良结局与关键信号通路失调相关，包括胰岛素/类胰岛素生长因子-1信号（insulin/IGF-1 signaling，IIS）、PI3K/AKT及MAPK通路。值得注意的是，DPhP扰乱神经发育相关基因的表达，尤其是调控多巴胺能和胆碱能神经传递的基因。与此一致，DPhP暴露线虫表现出趋化性和学习缺陷，伴多巴胺和γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）水平降低及多巴胺能神经元丢失，表明存在实质性神经毒性。综上，本研究提供全面证据表明DPhP跨模型干扰细胞生长、发育及神经功能，凸显其被低估的健康风险，并为环境安全评估提供关键依据。

论文解读：阐明增塑剂DPhP的毒性——来自动物体外至动物体内模型提示其具神经毒性与发育损害作用的证据

该研究发表于《Current Research in Toxicology》。邻苯二甲酸酯（phthalate esters，PAEs）广泛用作塑料制品增塑剂，其中二苯基邻苯二甲酸酯（diphenyl phthalate，DPhP）作为传统PAEs的替代物被用于聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）及食品包装材料，可从PVC基质中释放并检出於地表水及农田土壤，存在持续环境暴露风险。然而目前毒理学研究多集中于DEHP、DiBP及DiNP等，DPhP的系统性毒性谱及分子机制仍鲜有报道，其是否具神经毒性和发育毒性尚不明晰。为此，研究人员以人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）为体外模型、以秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）为体内模型，系统评价DPhP的细胞毒性、细胞周期影响、发育与运动毒性、氧化应激、信号通路基因表达改变及神经系统损伤，并阐释其分子机制。研究证实DPhP通过上调CDKIs（p21、p27）并下调cyclin–CDK复合物致HUVECs细胞周期改变；在线虫中引起生长迟滞、运动减弱、活性氧（reactive oxygen species，ROS）升高、IIS/PI3K–AKT/MAPK通路紊乱及多巴胺能和GABA能神经传递受损，提示其具发育毒性和神经毒性。该工作填补了DPhP跨模型毒性机制数据的空白，为环境健康风险评估提供实验依据。

主要关键技术方法：

研究人员采用美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）来源的HUVECs及野生型N2与BZ555［egIs1[P_dat-1::gfp]］秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，株系获自Caenorhabditis Genetics Center，CGC），以同步化L1期幼虫进行暴露实验。关键检测技术包括：MTT法测HUVECs细胞活力、平板克隆形成实验（colony formation assay）评估长期增殖能力、碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色流式细胞术分析细胞周期分布、Western blotting检测细胞周期相关蛋白（p21、p27、CDK2、Cyclin A2/D3/E1、FOXO3a）；线虫急性致死率测定求LD₅₀、体视显微镜下ImageJ测量线虫体长、20秒内体弯次数计数评估运动能力、NaCl趋化实验及丁二酮（diacetyl）条件学习实验分别评价化学感受与学习能力、DCFH-DA探针检测线虫ROS水平、溴酚蓝（brilliant blue）染色评估肠道完整性、qRT–PCR检测IIS/PI3K–AKT/MAPK/凋亡/神经发育相关基因表达、ELISA定量多巴胺与γ-氨基丁酸（GABA）含量、荧光显微镜观察BZ555线虫多巴胺能神经元形态及荧光强度定量，数据以单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计学处理。

研究结果

3.1. DPhP attenuates cell viability in HUVEC cells（DPhP降低HUVEC细胞活力）

经24 h DPhP处理的HUVECs MTT检测显示剂量依赖性活力下降，1 g/L组降至83.51％；平板克隆形成实验示0.1 g/L即显著减少克隆数（80.67降至68.67），1 g/L组降至61个，表明DPhP抑制HUVECs生长及集落形成能力。

3.2. DPhP induced cell cycle alterations in the HUVEC cell line（DPhP诱导HUVEC细胞周期改变）

流式细胞术显示低浓度（0.1 g/L）DPhP使S期比例由22.57％升至47.13％，高浓度（1 g/L）则致G₁期由52.5％升至62.03％。Western blotting证实DPhP上调CDKI p21和p27、下调CDK2及周期蛋白（低浓度下调Cyclin A2，高浓度下调Cyclin D3与Cyclin E1），高浓度亦上调FOXO3a，说明DPhP通过增强CDKI活性并抑制CDK–cyclin复合物扰乱G₁/S检查点致细胞周期改变。

3.3. DPhP exposure led to acute toxicity to C. elegans（DPhP对秀丽隐杆线虫具急性毒性）

10 g/L DPhP 24 h内全致死，5 g/L存活率4.76％，≤1 g/L 24 h无急性死亡。亚致死浓度下0.5–1 g/L显著抑制运动（20 s体弯次数减少），0.1–1 g/L均致生长迟滞——0.1 g/L体长缩短10.61％，1 g/L缩短58.16％，伴 vulval 发育延迟及角质层异常。

3.4. DPhP exposure led to a high ROS level in C. elegans（DPhP致秀丽隐杆线虫ROS水平升高）

DCF荧光检测示DPhP浓度依赖升高线虫ROS信号：0.1 g/L为对照1.72倍（文中表述为较对照增加0.72倍即达1.72倍参照），0.5 g/L为1.4倍，1 g/L为1.8倍，提示DPhP诱导促氧化偏移（pro-oxidative shift）。

3.5. DPhP exposure led to the dysregulation of gene expression（DPhP致基因表达失调）

qRT–PCR结果示低浓度（0.1 g/L）DPhP下调IIS通路核心基因 daf-2、sgk-1、akt-1、akt-2、pdk-1，上调 jnk-1 与 hsp-16.2；高浓度（0.5–1 g/L）上调 daf-2、age-1、akt-1、pdk-1、akt-2 及应激响应基因 hsf-1、skn-1、sir-2.1、gst-4、sod-3、pmk-1，但 jnk-1 与 hsp-16.2 下调提示应激防御耗竭。另上调 clk-2、nsy-1、sek-1、ctl-1、hsp-16.2，下调 let-363、sip-1，反映DNA损伤、免疫及代谢干扰。

3.6. DPhP exposure led to negative effect on the intestinal and nervous systems（DPhP损害肠道与神经系统）

溴酚蓝染色示肠道结构基本完整但0.5–1 g/L出现肠道扭曲；基因表达示低浓度下调凋亡基因 ced-3、cep-1 及极性调控 par-6 等，高浓度反之上调。神经递质代谢基因 ace-1/3/4、eat-4、dat-1 及各浓度下抗凋亡 ced-9、离子调节 nhx-2 上调。行为学示NaCl趋化指数及丁二酮联想学习指数随DPhP浓度升高下降；ELISA示多巴胺与GABA含量降低；BZ555荧光显示0.1 g/L DPhP致多巴胺能神经元（dat-1::gfp标记）荧光强度显著减弱、胞体缺失，证实DPhP损伤线虫神经系统尤其多巴胺能神经元。

讨论与结论总结

讨论指出DPhP抑制HUVECs增殖并通过FOXO3a–p21/p27–cyclin–CDK轴致G₁/S期细胞周期扰动，高浓度偏向应激性G₁阻滞，低浓度S期堆积更具化合物特异性；在线虫中DPhP诱导ROS升高、IIS通路双向调控（低浓度抑制/高浓度激活伴代偿性DAF-16/SKN-1入核抗氧化响应）、p38 MAPK（nsy-1–sek-1–pmk-1）激活、凋亡（ced-3/ced-9）与自噬相关基因（let-363）变化、神经递质基因（dat-1、eat-4、ace家族）失调致多巴胺/GABA降低及多巴胺能神经元丢失，最终表现为生长迟滞、运动障碍、趋化与学习缺陷。研究提示DPhP具跨模型细胞周期干扰、氧化应激失衡及神经信号扰乱的多模态毒性机制。

结论翻译：本研究采用体外细胞模型及体内秀丽隐杆线虫模型系统探讨DPhP毒理效应及分子机制。结果表明DPhP暴露诱导细胞G₁期细胞周期改变，机制关联p21与p27上调及CDK与cyclin表达下调。在秀丽隐杆线虫中DPhP致体长缩短及运动能力受损等发育异常，触发ROS水平升高伴IIS组分及p38 MAPK信号级联表达失调；神经发育相关基因及肠分化调控基因异常表达提示DPhP干扰调控生长发育与应激适应的神经内分泌网络。本工作提供重要证据表明DPhP通过扰乱细胞周期调控、氧化应激平衡及神经信号通路发挥多模式毒性作用。