S-棕榈酰化是一种可逆的蛋白质翻译后修饰，通过硫酯键将16碳脂肪酸链连接到半胱氨酸残基上。该修饰在调节蛋白质定位、构象、稳定性及与其他分子的相互作用方面至关重要，影响从免疫信号传导到细胞凋亡等多种生理功能。近年来，蛋白质棕榈酰化与多种疾病发病机制的联系日益紧密；本综述旨在对该领域的最新进展进行全面概述，涵盖其催化机制、功能意义及在疾病中的作用，同时探讨相关研究挑战以深化研究人员对S-棕榈酰化的理解。本综述并非提供详尽的总结，而是通过选取特定的近期案例来说明S-酰化的生物学重要性。
引言
蛋白质在初始生物合成后会经历翻译后修饰（Post-Translational Modifications, PTMs）以改变其结构与功能，从而丰富其复杂性及功能多样性，进而调控从信号传导到基因表达的无数细胞过程。在各类PTMs中，蛋白质脂化包含豆蔻酰化、异戊二烯化和棕榈酰化。S-棕榈酰化（通常更广泛地称为S-酰化）是一种重要的修饰，影响多种细胞生理过程，涉及约10%的人类蛋白质组，包括受体、酶、黏附蛋白等。因此，其失调与广泛的病理状态相关，包括癌症、免疫性疾病及神经退行性疾病。理解这种动态修饰在正常及疾病状态下的机制，为开发靶向治疗药物提供了巨大的机遇。S-酰化是一种可逆的翻译后修饰，涉及将不同链长的脂肪酸（通常为C14–C22，其中C16棕榈酸酯最为普遍）通过不稳定的硫酯键连接到底物蛋白的半胱氨酸残基上。其主要亚型S-棕榈酰化特指棕榈酸酯与半胱氨酸巯基的结合。之所以如此命名，是因为棕榈酰化发生在半胱氨酸巯基上，以此区别于靶向丝氨酸/苏氨酸羟基的O-酰化和修饰N端残基的N-酰化。哺乳动物的S-酰化由棕榈酰S-酰基转移酶（Palmitoyl S-acyltransferases, PATs）催化，也称为ZDHHC酶，这类酶共享4–7个跨膜结构域（Transmembrane Domains, TMDs）以及一个包含催化性天冬氨酸-组氨酸-组氨酸-半胱氨酸（Asp-His-His-Cys, DHHC）基序的保守锌指富含半胱氨酸区域。ZDHHC酶主要定位于高尔基体和内质网（Endoplasmic Reticulum, ER），少数被鉴定存在于质膜。鉴于ZDHHC酶能够转移一系列酰基链，将其更准确地描述为S-酰基转移酶（S-acyltransferases, S-ATs）而非棕榈酰S-酰基转移酶更为合适。
催化
S-酰化
目前关于ZDHHC酶中机制见解最广泛确立的是ZDHHC20，这得益于结构分析及其他多种实验手段的支持，包括化学生物学结合蛋白质组学、基于荧光技术的细胞生物学以及高效液相色谱肽基测定法。此外，ZDHHC15的晶体结构以及ZDHHC17的锚蛋白重复区结构也已解析，而ZDHHC9与辅助蛋白GCP16的复合物以及ZDHHC5与相同伴侣的冷冻电镜结构也在近期得到解析。然而，对于该类别中的大多数酶，研究人员仍缺乏详细且确定的结构和机制信息。尽管已在哺乳动物系统中鉴定出23种PATs，但尚不清楚它们是否全部发挥S-酰基转移酶的功能，确切的催化过程也未完全阐明。以ZDHHC20为例，研究人员假设并证实了一种两步乒乓机制，包括酶的自身酰基化，随后将酰基转移至底物蛋白。在该模型中，棕榈酰辅酶A插入由跨膜结构域形成的疏水口袋，使PATs发生自身酰基化并形成棕榈酰-PAT中间体，该中间体催化反应的慢步骤：将酰基链转移至底物蛋白。尽管乒乓机制得到了有力支持，但尚不确定其是否普遍适用于所有ZDHHCs。检测自身酰基化是验证乒乓模型的关键标准，但在整个ZDHHC家族中并未一致观察到此类中间体。尽管已采用多种实验方法，包括使用放射性标记的棕榈酸盐、炔烃功能化脂肪酸、荧光棕榈酰辅酶A类似物及叠氮基探针，全面的检测仍然不完整。进一步的研究将确定某些酶的自身酰基化是否与这些检测技术不相容，或者是否存在非经典催化的可能性。更复杂的是，不同研究间不一致的命名法（包括对ZDHHC亚型的矛盾编号）阻碍了对这些实验结果的系统比较。也有研究提出，PATs可能通过形成ZDHHC-棕榈酰辅酶A-底物的三元复合物作为中介，增加局部棕榈酰辅酶A浓度，促进棕榈酰辅酶A直接攻击底物反应性半胱氨酸。虽然PATs对棕榈酰辅酶A表现出底物特异性，但其他结构相似的酰基也可作为底物。尽管许多ZDHHC酶可能遵循乒乓机制，但酶催化的蛋白质棕榈酰化的潜在化学转化尚未完全明确。尽管如此，保守的DHHC基序（Cys156, His154, Asp153）是催化的核心，并支持一种广义酸碱机制。在自身酰基化步骤中，天冬氨酸153残基调节邻近组氨酸的质子化状态，使其能够作为广义碱去质子化催化半胱氨酸以产生反应性硫醇盐。该亲核试剂攻击棕榈酰辅酶A的羰基碳，从而在活性位点半胱氨酸（如Cys156）处产生硫酯连接的酰基-酶物种。在随后的酰基转移步骤中，来自ZDHHC20的结构学见解表明，His154位于靠近硫酯羰基的位置，可能作为广义酸发挥作用，通过质子化羰基氧来稳定过渡态，从而增加酰基碳的亲电性。这促进了底物半胱氨酸的亲核攻击，导致转硫酯化反应并再生活性DHHC基序。此外，C端胞质尾也贡献于酶活性。多种ZDHHC亚型（如zDHHC5, 6, 8, 9, 16, 17和20）在保守半胱氨酸残基（Cys236/237/245）处发生S-酰化，这已被证明可稳定跨膜结构域架构并提高催化效率。破坏该修饰会减少自身酰基化，突显了其功能重要性。
去酰化
S-酰化是一种可逆的翻译后修饰，因此酰化蛋白水平通过酰化和去酰化的动态相互作用紧密协调。负责S-去酰化的酶主要来自丝氨酸水解酶超家族，包括酰基蛋白硫酯酶（Acyl Protein Thioesterases, APTs）、棕榈酰蛋白硫酯酶（Palmitoyl-Protein Thioesterases, PPTs）和含α/β-水解酶结构域17蛋白（Alpha/Beta-Hydrolase Domain-containing 17 Proteins, ABHD17s）。这些酶共享一个活性位点丝氨酸，用于裂解硫酯键。为清晰起见，研究人员将这些酶统称为S-去酰基酶（S-deacylases, S-DAs），以与S-酰基转移酶相对应。
酰基蛋白硫酯酶
大多数S-酰化蛋白由酰基蛋白硫酯酶去酰化，其中APT1和APT2也称为溶血磷脂酶1（Lysophospholipase 1, LYPLA1）和溶血磷脂酶2（Lysophospholipase 2, LYPLA2）。这两种酶具有双重溶血磷脂酶和硫酯酶活性，并共享大量序列相似性（约64%），包括一个经历S-酰化的保守N端半胱氨酸残基（Cys2），该残基在膜结合中起关键作用。尽管同源性很高，APT1和APT2表现出不同的底物选择性。APT1介导β2-肾上腺素能受体的激动剂依赖性棕榈酰化，而APT2优先调节DHHC6等底物。然而，两种酶作用于重叠的靶标，包括H-Ras、生长相关蛋白43（Growth-Associated Protein-43, GAP-43）和NMNAT2。对APT2的机制研究揭示了一个多步膜相互作用过程。APT2首先通过一段带正电荷的残基通过远程静电引力与膜相互作用，使其疏水性β-舌插入膜中。随后，ZDHHC3/7对APT2进行棕榈酰化，增强APT2的结合和膜变形，从而将目标棕榈酸酯提取到其疏水口袋中，促进催化位点附近的硫酯键水解。APT1可以对自身和APT2进行去棕榈酰化，这种调节与APT的流体定位和去棕榈酰化活性有关。
棕榈酰蛋白硫酯酶
除APTs外，蛋白棕榈酰硫酯酶1（Protein Palmitoyl Thioesterase 1, PPT1）通过甘露糖6-磷酸受体介导的途径在溶酶体中使蛋白质去酰化。蛋白棕榈酰硫酯酶2（Protein Palmitoyl Thioesterase 2, PPT2）与PPT1有26%的序列同一性，并且优先水解棕榈酰辅酶A而非棕榈酰化蛋白。尽管它们结构相似，但脂质结合域螺旋的构象差异赋予了PPT2底物选择性，因为其结合槽比PPT1小，阻止其与具有较大头基的脂肪酸（如棕榈酰半胱氨酸）结合，这表明两者具有独特且不冗余的功能。然而，PPTs之间复杂的相互作用仍未被充分表征。
含α/β-水解酶结构域17 A/B/C（ABHD17 A/B/C）
在ABHD家族中，尽管ABHD10和ABHD16A也与去酰化有关，但ABHD17亚家族是最被广泛表征的去酰酶。它由三个亚型组成：ABHD17A、ABHD17B和ABHD17C，它们在脊椎动物中广泛表达，并定位于内体区室、质膜（Plasma Membrane, PM）以及自噬体和溶酶体。ABHD17蛋白的质膜靶向由其N端区域控制，该区域包含多个保守半胱氨酸残基（C10, C11, C14, C15, C18），以及一个靠近N端的环状结构，该环侧翼于疏水腔。N端富含半胱氨酸结构域的自身酰基化促进了与PM的关联，而大多数底物位于PM。对ABHD17A的机制研究支持一种逐步转运途径。最初向反面高尔基体网络的运输是由富含半胱氨酸基序附近的疏水和芳香族残基驱动的。随后在该区室内发生C14和C15的棕榈酰化，接着通过YXX?基序分选至内体膜，在那里发生C10、C11和C18的额外棕榈酰化，并作为一个调节检查点允许其进入PM。一旦递送至膜，酰化的N端插入脂质双分子层，加上疏水环的参与，稳定了酶并诱导疏水腔的构象重排，从而增强底物提取和在底物结合口袋内的容纳。此外，破坏该区域（无论是删除N端还是突变富含半胱氨酸基序内的关键半胱氨酸残基）都会损害膜定位，而疏水环内的突变会改变口袋的可及性，但不会阻止膜结合。在功能上，ABHD17酶调节底物的去酰化，如突触后密度蛋白95（Postsynaptic Density Protein 95, PSD95）、N-Ras和NOD2（一种细胞内先天免疫受体），并额外调节ZDHHCs的自身棕榈酰化，强调了其在控制酰化动力学方面的更广泛作用。总体而言，尽管有这些见解，研究人员对S-去酰基酶的详细了解及其结构特征、底物结合相互作用和选择性以及酶动力学仍然非常有限；需要进一步努力来阐明S-去酰化的调控机制。
S-棕榈酰化的生理作用
脂肪酸附着到蛋白质上会增加其疏水性；因此，可以协调亚细胞定位、构象、稳定性及与其他分子的相互作用。
亚细胞定位
S-棕榈酰化的独特可逆性使其能够介导蛋白质在细胞器之间的运输及向膜的定位。作为脂质锚，疏水性棕榈酸酯增强了蛋白质与膜的亲和力。在受S-棕榈酰化影响的蛋白质中，脂肪酸转位酶CD36是一种多功能膜糖蛋白，参与脂肪酸稳态和细胞炎症反应，从而协同促进非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis, NASH）的发展。在NASH小鼠模型中观察到CD36棕榈酰化增加及其向肝细胞PM的定位，而抑制CD36则降低了其疏水性和PM定位，随后减轻了炎症反应和NASH的发展。因此，CD36棕榈酰化可作为NASH治疗的靶点。
构象与稳定性
除了调节蛋白质定位外，S-棕榈酰化还可以改变蛋白质的构象和稳定性。Caspase-6（CASP6）是一种在神经元凋亡过程中协调神经元变性的半胱氨酸蛋白酶，在阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经系统疾病中发挥关键作用。CASP6的异常激活是亨廷顿病的早期致病事件，导致亨廷廷蛋白裂解产生有毒的N端HTT片段，促进神经退行性变。通过计算建模预测，DHHC17介导的CASP6在Cys264和Cys277处的棕榈酰化可通过两种机制抑制CASP6激活：首先，第一个位点的棕榈酰化阻碍了激活位点并延长了催化二联体（Cys163/His121）的距离，阻止了Cys163对Asp的亲核攻击。其次，Cys277棕榈酰化引入了长棕榈酰链的立体位阻，拦截了另一个CASP6分子的接近以及随后的二聚化和激活。程序性死亡配体1（Programmed Death Ligand 1, PD-L1）在癌细胞中高表达，并与T细胞上的程序性死亡蛋白1（Programmed Cell Death Protein 1, PD-1）相互作用以阻碍T细胞的抗肿瘤活性。DHHC3在Cys272处对PD-L1进行的棕榈酰化通过阻滞其泛素化增加了其稳定性，而抑制棕榈酰化则通过诱导泛素化促进其溶酶体降解。因此，这些发现为攻克PD-L1介导的癌症免疫逃逸提出了新方法。这些例子证明了S-棕榈酰化如何关键地影响蛋白质构象和稳定性，强调了其在病理生理过程中的重要性。
生物分子相互作用
最后，S-棕榈酰化诱导的亲脂性可以改变蛋白质-蛋白质相互作用。人类黏附G蛋白偶联受体（Adhesion G-Protein Coupled Receptors, aGPCRs）是调节多种过程的分子开关；孤儿受体GPR97是aGPCR家族的成员，与异源三聚体G0蛋白偶联以启动下游信号传导，调节淋巴重塑和B细胞发育。G0蛋白胞质尾部的棕榈酰化促进了酰基链插入GPR97-G0复合物七次跨膜核心深处，导致GPR97配体结合袋内残基的变构稳定，增强了其与糖皮质激素等配体的亲和力。
疾病状态下的S-棕榈酰化
癌症
S-棕榈酰化与多种癌症之间的关系正逐渐被阐明，其促癌或抑癌效应因癌症种类而异。几种肿瘤相关蛋白需要S-棕榈酰化才能定位于PM以激活致癌通路。即δ-连环蛋白是一种在前列腺癌中上调的致癌蛋白。它通过与PM上的表皮生长因子受体蛋白（Epidermal Growth Factor Receptor Protein, EGFR）相互作用，阻止其泛素化，激活细胞外信号调节激酶（Extracellular Signal-Regulated Kinase, ERK1/2）通路，导致癌症增殖和转移增加。它还通过与PM E-钙黏蛋白（一种负责细胞黏附和肿瘤抑制的蛋白）相互作用诱导其降解，释放β-连环蛋白和致癌信号。将δ-连环蛋白的Cys棕榈酰化位点突变为丝氨酸，形成“去棕榈酰化”的δ-连环蛋白突变体，减少了其向PM的定位，降低了其与EGFR和E-钙黏蛋白的相互作用。因此，携带突变δ-连环蛋白的前列腺细胞具有较低的细胞增殖、迁移和黏附能力。同样，在乳腺癌细胞中破坏ZDHHC9表达或通过位点特异性点突变损害PD-L1棕榈酰化，可增强对T细胞活性的反应性，从而减弱肿瘤生长。相反，ZDHHC22介导的雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin, mTOR）棕榈酰化诱导其不稳定，抑制随后的磷酸肌醇三激酶（Phosphoinositide Three Kinases, PI3K）/AKT/mTOR通路，通过细胞周期停滞和凋亡减少乳腺癌肿瘤生长和增殖。S-棕榈酰化可以通过激活肿瘤抑制信号通路抑制肿瘤生长，ZDHHCs的过表达与癌症抑制相关。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（Insulin-Like Growth Factor 2 mRNA Binding Protein, IGF2BP1）调节RNA稳定性和翻译。ZDHHC1在Cys337处对IGF2BP1进行棕榈酰化，使其能够结合到其下游靶标脂肪酶G（Lipase-G, LIPG）mRNA的N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）位点，通过m6A修饰使LIPG mRNA不稳定，随后降低LIPG表达。LIPG是一种协调脂质代谢的内皮脂肪酶，与癌症中异常的能量供应有关。因此，其下调阻碍了结直肠癌中细胞内脂质高密度脂蛋白（High-Density Lipoprotein, HDL）的摄取，减少了细胞增殖。总体而言，S-棕榈酰化对致癌作用有着显著且独特的影响，在致癌蛋白和肿瘤抑制行为之间取得平衡。
免疫与自身免疫性疾病
S-棕榈酰化涉及众多免疫信号通路，如干扰素基因刺激因子（Stimulator of Interferon Gene, STING）、吞噬作用和凋亡。因此，其异常活动导致各种炎症和自身免疫性疾病的发展，包括结肠炎和炎症性肠病（Inflammatory Bowel Diseases, IBD）。细胞质DNA指示病原体入侵、细胞应激和组织损伤；因此，检测细胞质DNA对于先天免疫至关重要。环GMP-AMP合酶（Cyclic GMP-AMP Synthase, cGAS）蛋白是最突出的细胞质DNA检测器：它识别并结合细胞质双链DNA，随后二聚化为2:2的cGAS-DNA复合物以激活STING通路，触发随后的免疫介质（如抗病毒I型干扰素（Type 1 Interferons, IFNs）和促炎细胞因子）的合成，从而防御DNA病毒；cGAS无法区分自身和非自身DNA。因此，在有丝分裂期间，包括mtDNA和染色质在内的细胞质自身DNA的存在，需要对cGAS-STING通路进行精细控制，以防止过度激活和慢性炎症。cGAS在Cys474处的S-棕榈酰化导致构象变化，减少DNA结合，从而限制cGAS-DNA复合物的形成和随后的通路激活。此外，cGAS-DNA结合导致cGAS与ZDHHC18的共定位增加，以及cGAS与ZDHHC18的结合自由能降低。因此，研究人员提出这种修饰作为cGAS-STING通路的负反馈以微调cGAS-STING介导的免疫反应。有趣的是，在同一通路内，STING在Cys88/91处发生S-棕榈酰化，使其能够在高尔基体的脂质筏内聚集，招募TANK结合激酶1（TANK-Binding Kinase 1, TBK1）和干扰素调节因子3（Interferon Regulatory Factor 3, IRF3），并触发IRF3磷酸化以启动免疫基因的转录。因此，S-棕榈酰化在单一通路中具有多方面的影响。除了先天免疫，S-棕榈酰化在适应性免疫中也起着关键作用。辅助性T细胞17（TH17）调节组织稳态，特别是在肠黏膜中。其过度激活和分化参与IBD和结肠炎。TH17细胞的分化是由信号转导及转录激活因子3（Signal Transducer and Activator of Transcription 3, STAT3）的棕榈酰化-去棕榈酰化循环触发的，该循环由DHHC7和APT2介导。首先，STAT3在Cys108处被DHHC7棕榈酰化以诱导膜定位和磷酸化。磷酸化的STAT3随后被APT2去棕榈酰化，将其易位至细胞核，激活基因以触发TH17细胞分化。因此，靶向STAT3棕榈酰化的调节以抑制TH17细胞，为治疗由非典型TH17活性引起的自身免疫性疾病提供了一条有前途的途径。总之，这些见解强调了S-棕榈酰化在调节免疫中的重要性，并突出了解决炎症和自身免疫性疾病的潜在靶点。
神经退行性疾病
S-棕榈酰化对于健康的大脑功能至关重要，从神经元树突生长和神经传递到控制突触膜和细胞内细胞器之间的蛋白质运输以实现突触可塑性。因此，S-棕榈酰化失调与各种神经退行性疾病相关，包括阿尔茨海默病、亨廷顿病等。本节将以阿尔茨海默病为例，探讨S-棕榈酰化如何驱动神经系统疾病的发病机制。阿尔茨海默病的特征是神经毒性细胞外β-淀粉样蛋白（Amyloid-beta, Aβ）斑块和细胞内神经原纤维缠结（Neurofibrillary Tangles, NFTs），表现为认知能力下降和进行性记忆力减退。Aβ是通过β-和γ-分泌酶对淀粉样前体蛋白（Amyloid Precursor Protein, APP）的蛋白水解加工产生的，这两个过程都受到S-棕榈酰化的协调。即β-位点APP裂解酶1（Beta-Site APP Cleaving Enzyme 1, BACE1）在Cys474、478、482和485处的棕榈酰化减少了Aβ斑块、聚集并减轻了AD小鼠模型的记忆力丧失。ZDHHC12介导的α-分泌酶棕榈酰化促进了APP的非淀粉样变性α-切割，并防止Aβ产生。相反，APP在Cys186和187处的棕榈酰化增加了其与脂质筏的相互作用，诱导γ-分泌酶介导的裂解和Aβ产生。硒蛋白K（Selenoprotein K, SELENOK）是一种通过小胶质细胞调节大脑免疫反应的关键蛋白。具体而言，SELENOK调节其下游靶标：CD36蛋白（一种小胶质细胞质膜受体，对Aβ识别、结合和小胶质细胞吞噬清除至关重要）的棕榈酰化。通过与内质网定位的DHHC6相互作用，SELENOK促进CD36棕榈酰化和向小胶质细胞PM的定位，从而促进Aβ吞噬作用。因此，在AD小鼠模型中观察到SELENOK下调和CD36棕榈酰化受损，可能是由于小胶质细胞Aβ吞噬作用受到抑制，加剧了小鼠的认知缺陷。S-棕榈酰化的影响还延伸到其他神经系统疾病。突变的亨廷廷蛋白表现出棕榈酰化减少，而APT抑制在亨廷顿病中发挥神经保护作用。在帕金森病中，synaptotagmin-11在Cys39和40处的棕榈酰化与α-突触核蛋白膜结合增加及神经元内积累相关，而APT1抑制促进了健康的微管相关蛋白（Microtubule-Associated Protein, MAP6）与囊泡的相互作用，降低了神经毒性。这些例子强调S-棕榈酰化是神经元健康的重要贡献者，对大脑免疫反应、蛋白质加工和运输产生复杂多样的影响。
挑战与展望
尽管S-酰化于1979年被发现，但其许多方面仍未解决；关于棕榈酰化酶的酶动力学和底物识别的信息仍然缺乏。此外，研究人员对S-酰化调控机制及其与其他PTMs的相互作用的理解仍处于初级阶段。因此，利用S-酰化作为治疗靶点仍然具有挑战性。解决这些挑战因缺乏PAT选择性抑制剂而变得复杂。2-溴棕榈酸（2-Bromopalmitic Acid, 2-BP）是一种常见的竞争性不可逆抑制剂，通过阻止棕榈酰-PAT中间体的形成来阻断棕榈酰化。然而，其对APT和其他含半胱氨酸酶（如葡萄糖-6-磷酸酶和单酰基甘油转移酶）的显著脱靶抑制，加上其细胞毒性，限制了其治疗潜力并使涉及2-BP的S-棕榈酰化动力学的解释复杂化。其他抑制剂，包括浅蓝菌素和衣霉素，同样存在选择性差和毒性的问题。相比之下，氰基肉豆蔻酰胺（Cyano-Myracrylamide, CMA）看起来更有希望。已证明它具有相似的效力、更低的毒性和更高的选择性，且不抑制S-去酰基酶。然而，它是非特异性的，靶向广泛的ZDHHCs，这限制了其实用性。因此，迫切需要开发更具选择性的PAT抑制剂。其他影响S-棕榈酰化的现代药物研发途径也开始出现，包括肽设计及靶向蛋白降解。检测方法的改进推动了该领域的发展。早期的方法依赖于将放射性标记的脂肪酸费力且低灵敏度地掺入蛋白质中，然后进行免疫沉淀。2004年引入的革命性酰基-生物素交换（Acyl-Biotin Exchange, ABE）方法，结合液相色谱-质谱（LC–MS）蛋白质组学，实现了棕榈酰化蛋白的全局分析。该技术首先使用N-乙基马来酰亚胺（N-ethylmaleimide, NEM）封闭棕榈酰化蛋白的游离巯基，然后使用羟胺选择性裂解棕榈酸酯-硫酯键，从而标记和检测棕榈酰化位点。其他酰基交换方法，如酰基树脂辅助捕获（Acyl-Resin Assisted Capture, acyl-RAC）和酰基聚乙二醇交换（Acyl-Polyethylene-Glycol Exchange, acyl-PEG）也越来越多地被使用。然而，ABE和acyl-RAC可能会出现假阳性，因为它们仅证实硫酯键的存在。此外，它们无法说明棕榈酰化-去棕榈酰化动力学或棕榈酰化化学计量。Acyl-PEG通过用PEG标记释放的半胱氨酸对此进行了改进，诱导了依赖于棕榈酰化位点数量和棕榈酰化化学计量的SDS-PAGE上的质量偏移。或者，生物正交化学为S-棕榈酰化提供了新的研究工具，具有更低的假阳性率：炔烃或叠氮化物修饰的脂肪酸类似物被整合到蛋白质中，能够通过Staudinger连接或点击化学反应检测S-棕榈酰化。虽然点击化学中的铜毒性限制了活细胞成像，但将其与“凸孔”化学遗传系统相结合可实现PAT特异性标记和新PAT靶标的鉴定，提供了优于酰基交换方法的优势。针对生物正交检测设计的多种叠氮基、炔基和异戊二烯探针显示出不同程度的成功；尽管存在局限性，2-BP、浅蓝菌素及其类似物仍是有价值的探针。考虑到讨论过的缺点，建议协同使用技术以更好地表征S-棕榈酰化。除了检测工具外，计算系统和实验方法也为S-酰化网络提供了见解。深度学习模型预测酰化位点，而正交设计策略识别新靶标，为理解S-酰化提供了互补的方法。总体而言，S-棕榈酰化是一种关键的PTM，显著影响蛋白质定位、构象和生物分子相互作用，影响多种通路和病理状态。随着蛋白质组学技术的进步，应对现有挑战变得越来越可行，推动重大发现。最后，将疾病特异性蛋白质组学数据与酶相互作用和表达数据相结合，将进一步揭开S-棕榈酰化的神秘面纱，并突出有前景的治疗靶点。
