Kinsenoside通过激活Akt信号通路并抑制细胞凋亡，在小鼠模型中缓解MPTP诱导的帕金森病

《Behavioural Brain Research》：Kinsenoside Alleviates MPTP-Induced Parkinson’s Disease via Akt Activation and Apoptosis Inhibition in a Mouse Model

　　

叶宗明|宋伟文|李明哲|张志一|施文玲

台湾屏东科技大学综合研究服务中心，屏东

摘要

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病，主要表现为运动功能障碍；然而，最近的研究强调了其广泛的非运动症状，包括认知障碍和心理伤害。虽然多巴胺能药物在早期阶段能有效控制运动症状，但疗效往往会下降，且随着疾病进展症状可能会加重。Anoectochilus formosanus中的主要生物活性化合物Kinsenoside具有多种药理作用，但其治疗PD的潜力尚未得到充分探索。本研究评估了Kinsenoside是否能够缓解由1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的小鼠模型中的PD症状。行为结果表明，Kinsenoside显著减轻了极点测试中的运动迟缓，减少了牵引测试中的运动缺陷，并提高了被动回避测试中的长期认知记忆。此外，Kinsenoside治疗显著恢复了PD小鼠黑质中的多巴胺（DA）水平并增加了酪氨酸羟化酶（TH）的表达。从机制上讲，Kinsenoside激活了Akt信号通路，并降低了Bcl-2相关X蛋白（Bax）与B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）的蛋白质表达比例，从而抑制了神经元凋亡。这些发现表明Kinsenoside具有强大的神经保护作用，是缓解帕金森病相关运动和非运动症状的有希望的治疗候选物。

引言

帕金森病（PD）是一种常见的神经退行性疾病[1]。其病理特征是中脑黑质致密部（SNpc）中多巴胺能神经元的退化，以及从黑质到纹状体的轴突丧失[2]。纹状体中多巴胺（DA）的耗竭是PD主要运动症状的原因。除了多巴胺能神经元的丧失外，PD的另一个神经病理学特征是神经元细胞体内存在由α-突触核蛋白（α-syn）组成的不溶性细胞质包涵体[3]。此外，PD患者的壳核、尾状核和苍白球形成的控制通路无法正常工作[4]。当黑质受损时，这些神经元无法正常产生多巴胺，导致输送到纹状体的多巴胺逐渐减少，而纹状体控制着运动和平衡。这种紊乱破坏了多巴胺和乙酰胆碱这两种神经递质之间的平衡，从而导致PD的运动症状[5]，包括运动迟缓、震颤、僵硬和姿势不稳。

此外，还有非运动症状（NMS），如心理和认知障碍[6]、胃肠道疾病[7]以及嗅觉功能障碍[8]。痴呆是PD的常见特征。在帕金森病发病前或第一年内出现痴呆的患者被归类为路易体痴呆（DLB）。那些在运动症状出现一年后出现痴呆的患者被诊断为伴有痴呆的帕金森病（PDD）[9]。除了认知障碍外，早期症状还可能包括僵硬、震颤、步态不稳和反复跌倒。其患病率仅次于阿尔茨海默病，是第二常见的退行性痴呆类型[10]。

从机制上讲，先前的研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt通路的激活及其下游转录因子（如GSK3β、mTOR、BAD、CREB和Forkhead）在细胞存活、代谢和神经元功能中起着关键作用。在PD的发展过程中，GSK-3的激活增加了多巴胺能神经元中的caspase-3表达，导致细胞凋亡。先前的研究提示Akt可能通过磷酸化GSK-3α的Ser-21或GSK-3β的Ser-9来抑制GSK-3的活性[11]。此外，它还通过抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的拮抗剂Bad来调节细胞凋亡，从而支持多巴胺神经元的存活和生长。此外，氧化应激可导致神经元死亡和凋亡，促进PD的进展。PI3K/Akt通路也被发现通过影响GSK-3、mTOR和FoxO3a等分子靶点来调节氧化应激[12]。

Anoectochilus formosanus是兰科Anoectochilus属的一种植物。传统上被视为药用植物，Anoectochilus formosanus含有多种活性化合物，包括多糖、氨基酸、生物碱、黄酮类和有机酸。目前它被用于预防和治疗糖尿病、高脂血症、肝炎和肿瘤[13]、[14]、[15]、[16]、[17]。苷类是Anoectochilus formosanus中的主要活性化合物，Kinsenoside就是从中分离出来的一种苷[18]。研究表明，Kinsenoside具有血管保护作用，并能有效降低血糖和胆固醇水平。它还能增强链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的抗氧化能力[19]。此外，Kinsenoside表现出多种药理活性，包括肝保护、降糖效果、抗高脂血症作用、抗炎作用、血管保护和抗骨质疏松作用[20]。此外，Kinsenoside还能抑制一氧化氮（NO）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）等炎症因子，同时促进抗炎细胞因子白细胞介素-10（IL-10）的产生，从而减少小鼠巨噬细胞中的脂多糖（LPS）诱导的炎症[21]。它还在四氯化碳（CCl₄）诱导的小鼠急性肝损伤模型中显示出肝保护作用，并对其他免疫器官具有保护作用[22]、[23]。

目前关于PD的动物研究主要使用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）、6-羟基多巴胺（6-OHDA）、百草枯和罗通宁等药物，通过氧化应激诱导大脑黑质致密部的细胞死亡，从而支持PD的发展[24]。其中，MPTP是一种众所周知的神经毒素，会导致多巴胺神经元坏死。其分子结构与多巴胺相似，能够穿过血脑屏障（BBB）。其代谢物1-甲基-4-苯基吡啶inium（MPP⁺）通过多巴胺转运蛋白（DAT）进入多巴胺能神经元，触发黑质中的特定凋亡因子（如细胞色素C和caspases），进一步促进黑质细胞的凋亡[25]。此外，MPTP还可以通过激活小胶质细胞和巨噬细胞来升高促炎因子（如TNF-α和干扰素），从而引发炎症反应[26]。除了深部脑刺激（DBS）和饮食控制（例如，嘌呤饮食以调节抗氧化尿酸）等临床干预措施[27]外，寻找新的口服神经保护小分子对于PD的治疗具有不可替代的转化价值。此外，天然黄酮类和苷类（如Isoorientin）已被证明能有效抑制外周动脉粥样硬化中的细胞炎症和死亡[28]，本研究进一步扩展了这些化合物在中枢神经系统中的抗凋亡作用。

尽管先前的研究强调了Kinsenoside的多方面药理益处，包括强大的抗炎和抗氧化特性，但其在帕金森病中的治疗潜力仍需进一步探索。在本研究中，我们假设Kinsenoside可以穿过血脑屏障，并通过刺激p-Akt/Akt细胞存活通路并随后抑制细胞凋亡来保护多巴胺能神经元免受MPTP引起的神经毒性。为了验证这一假设，我们系统地评估了口服Kinsenoside对MPTP诱导的小鼠模型中的运动和认知行为的剂量依赖性效应。此外，我们还彻底研究了黑质内的分子和组织病理学机制。我们的发现提供了首个功能性证据，证明Kinsenoside是管理神经退行性疾病的潜在转化候选物。

章节片段

化合物分离和鉴定的通用仪器操作

NMR光谱在室温下使用Varian Mercury Plus 400 NMR光谱仪（400 MHz）在（CD₃)₂SO中记录¹H（100 MHz）和¹³C（400 MHz），以残留溶剂信号作为内标。HR-EI-MS在Thermo Q-Exactive Plus质谱仪上进行。薄层色谱（TLC）在硅胶60 F₂₅₄板上进行（Merck Millipore，美国伯灵顿）。使用Merck Millipore的硅胶、Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉）和LiChroprep

提取和分离

用乙醇提取Anoectochilus formosanus的整个植物，所得粗提物悬浮在水中。该悬浮液依次用乙酸乙酯（EtOAc）进行分离，得到可溶于EtOAc和可溶于水的组分。可溶于水的组分进一步通过色谱技术分离和纯化，最终分离出Kinsenoside。Kinsenoside的结构通过质谱（MS）和¹H及¹³C NMR光谱确定

讨论

先前的研究表明Kinsenoside含有γ-丁内酯，这是一种具有生物活性的小分子化合物[38]、[39]。含有γ-丁内酯的药物临床用于利尿、抗癌、避孕、心脏病和青光眼治疗。在神经退行性疾病研究中，肉桂中的酚类γ-丁内酯可以保护SH-SY5Y细胞免受放线菌素诱导的死亡[40]。PDD和DLB都与阿尔茨海默病相关，涉及α-突触核蛋白（α-syn）、β-淀粉样蛋白和tau等生物标志物[41]。

结论

本研究首次表明Kinsenoside可以剂量依赖性地减少MPTP诱导的PD小鼠模型中的运动和认知缺陷。它通过恢复纹状体中的多巴胺和TH表达来保护多巴胺能神经元，这与p-Akt/Akt存活通路的激活和Bax/Bcl-2介导的凋亡抑制有关。局限性包括缺乏对脑组织中Kinsenoside水平的定量分析、需要LC-MS/MS研究，以及依赖于急性MPTP模型，该模型并不

资金声明

本研究未获得任何资助。

CRediT作者贡献声明

宋伟文：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，验证，正式分析。叶宗明：可视化，验证，方法学，研究，正式分析。张志一：方法学，正式分析。李明哲：方法学，研究，正式分析。施文玲：撰写 – 审稿与编辑，可视化，验证，监督，资源管理，项目协调，方法学，资金获取，正式分析，概念化。

写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明

在准备这项工作时，作者使用了“Google Gemini”和“Grammarly”来提高手稿的清晰度并确保语法正确性。使用这些工具/服务后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对发表文章的内容负全责。

利益冲突

作者声明没有利益冲突。

致谢

我们感谢屏东科技大学的“多功能正负压动物设施”在动物实验方面的协助。