白芷素通过缓解氧化应激和神经炎症促进缺血损伤后神经干/祖细胞的存活及神经元分化

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Bergapten attenuates oxidative stress and neuroinflammation to promote the survival and neuronal differentiation of neural stem/progenitor cells after ischemic insult

　　

缺血性卒中（ischemic stroke）是全球主要的致死和致残原因之一。恢复过程中面临的重要挑战是缺血半暗带中的恶劣微环境，其特征为过度的氧化应激和神经炎症，导致大量神经元死亡并阻碍内源性神经干/祖细胞（NSPCs）的再生潜能。白芷素是一种天然香豆素类衍生物，已在多种疾病模型中显示出抗氧化和抗炎特性，提示其可能具有神经保护作用。本研究旨在探讨白芷素能否在模拟缺血性卒中模型中对抗氧化应激和炎症，进而促进NSPCs的存活、增殖及神经元分化。研究人员建立了利用过氧化氢（H₂O₂）处理原代小鼠NSPCs和BV2小胶质细胞的体外氧化应激模型。NSPCs通过巢蛋白（Nestin）、SRY盒转录因子2（SOX2）及配对盒蛋白6（PAX6）的免疫荧光染色进行鉴定。白芷素的作用通过以下方面进行评估：1）NSPCs内活性氧（ROS）水平和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP nick end labeling（TUNEL）细胞凋亡检测；2）BV2细胞内ROS水平及M1/M2极化状态[诱导型一氧化氮合酶（iNOS）/精氨酸酶-1（Arg-1）]；3）应激条件下NSPCs向神经元或星形胶质细胞的分化[神经元特异性Ⅲ类β-微管蛋白（TUJ-1）]。H₂O₂处理诱导了NSPCs显著的氧化应激和凋亡，表现为ROS水平升高和TUNEL阳性细胞增多；同时触发BV2小胶质细胞产生ROS并向促炎性M1表型（iNOS⁺）转变。关键的是，在H₂O₂诱导的应激下，NSPCs向神经元（TUJ-1⁺细胞）的分化能力受损。白芷素治疗有效缓解了这些有害效应：降低NSPCs中ROS水平和凋亡，抑制BV2细胞的M1极化，最重要的是恢复了NSPCs向神经元分化的能力。研究结果表明，白芷素在缺血性损伤的神经细胞模型中具有强效的抗氧化和抗炎特性。通过改善恶劣微环境，白芷素增强NSPCs的存活并促进其向神经元分化。该研究首次提供了支持白芷素作为促进缺血性卒中后内源性神经发生和功能修复的有前景治疗候选药物的实验证据。

缺血性卒中是由脑动脉闭塞引起的毁灭性神经系统事件，也是成人长期残疾的主要原因。初始缺血损伤触发一系列复杂的病理事件级联反应，包括兴奋毒性、离子失衡和能量衰竭。随后发生的再灌注无论是自发性的还是通过临床干预实现的，都会产生继发性损伤波，即缺血-再灌注损伤，其主要由活性氧（ROS）的过度产生和强烈的神经炎症反应激活所驱动。这种梗死周围区域的有害微环境加剧了神经元凋亡和坏死，导致不可逆的脑损伤。当前的治疗策略，如溶栓和取栓，受到狭窄治疗时间窗的严格限制，且无法逆转已建立的神经元丢失。因此，研究重点已转向促进脑修复和再生。

成年哺乳动物脑内 harbors 内源性神经干/祖细胞（NSPCs），主要位于脑室下区和海马齿状回，具有自我修复潜能。缺血性损伤后，这些NSPCs被激活并发生增殖，但其再生能力受到卒中后环境的严重阻碍。压倒性的氧化应激损伤细胞脂质、蛋白质和DNA，直接损害NSPCs；同时，活化的小胶质细胞（脑内驻留免疫细胞）向促炎性M1表型极化，释放肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子，进一步抑制NSPCs增殖并使其分化偏离神经元而偏向星形胶质细胞，促进胶质瘢痕形成。因此，同时缓解氧化应激和神经炎症的治疗策略可为内源性NSPCs的生存、增殖及向功能性神经元分化创造有利环境，从而促进结构和功能恢复。

白芷素（5-甲氧基补骨脂素）是一种存在于香柠檬和其他柑橘类水果中的天然呋喃香豆素，因其多样的药理活性而备受关注。研究已报道其强效的抗氧化作用，如在心肌梗死模型中减小梗死面积和脂质过氧化；其抗炎特性则体现在抑制促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β）产生及调节巨噬细胞极化等方面。值得注意的是，白芷素表现出高血脑屏障通透性，使其成为中枢神经系统疾病的合适候选药物。尽管具有这些 promising 特性，其对卒中恢复关键神经成分——特别是缺血损伤背景下的NSPCs和小胶质细胞——的直接作用在很大程度上仍未被探索。

研究人员开展了以下研究：利用过氧化氢（H₂O₂）在体外模拟缺血性损伤的氧化应激成分，首先表征H₂O₂对NSPCs凋亡、小胶质细胞激活和神经发生的有害影响，进而探究白芷素在对抗这些效应方面的治疗潜力，重点研究其在减少ROS、抑制小胶质细胞M1极化、增强NSPCs存活以及关键性地挽救神经元分化方面的作用。研究样本来源为胚胎期15天（E15）C57BL/6小鼠端脑区域的原代NSPCs，以及BV2小胶质细胞系。

研究采用的主要关键技术方法包括：免疫荧光染色技术（用于NSPCs表型鉴定、TUNEL凋亡检测、小胶质细胞M1/M2极化标志物检测及紧密连接蛋白检测）、DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平（结合荧光显微镜成像和流式细胞术定量）、体外分化实验（无生长因子分化培养基联合NOTCH抑制剂DAPT促进神经元分化）、血管形成实验（Matrigel基质胶上的内皮细胞管腔形成实验评价血管发生能力）以及FITC-葡聚糖跨内皮渗透性实验（评价内皮屏障功能）。

研究结果部分：

隔离、培养与表征原代小鼠NSPCs：从C57BL/6小鼠成功分离原代NSPCs。在增殖条件下，这些细胞形成特征性的自由漂浮神经球。通过免疫荧光染色对神经球进行NSPCs标志物检测，数据显示所有细胞对巢蛋白（NSPCs中间丝蛋白）、SOX2（维持干细胞多能性的转录因子）和PAX6（神经发育关键转录因子）均呈强阳性表达。这些高表达率的标志物证实了NSPCs的成功富集和培养，可用于后续实验。

白芷素保护NSPCs免受H₂O₂诱导的氧化应激和凋亡：为模拟缺血后遇到的氧化应激，NSPCs暴露于400 μM H₂O₂。该处理导致细胞内ROS水平显著升高，并直接增加细胞死亡，表现为TUNEL阳性凋亡细胞数量显著增加。白芷素治疗显著减弱了这些效应，治疗组显示H₂O₂诱导的ROS产生大幅减少，TUNEL阳性细胞数量相应减少。其中100 μM白芷素的效果最佳，其ROS平均荧光强度和TUNEL阳性凋亡细胞比例均显著低于20 μM或40 μM剂量组。与单独H₂O₂组相比，40 μM和100 μM白芷素组均显著降低了ROS平均荧光强度和TUNEL阳性凋亡细胞数量。这些结果表明，白芷素能有效缓解氧化应激并在病理条件下保护NSPCs免于凋亡。

白芷素减轻BV2细胞氧化应激并调节小胶质细胞极化：研究人员进一步研究了白芷素对小胶质细胞（神经炎症的关键介质）的影响。400 μM H₂O₂暴露诱导BV2小胶质细胞内ROS水平显著升高，证实氧化应激也能直接激活免疫细胞。白芷素添加显著降低了H₂O₂诱导的BV2细胞ROS水平，100 μM组的ROS平均荧光水平显著低于20 μM或40 μM组。流式细胞术结果显示出相似趋势。此外，免疫荧光染色显示H₂O₂处理促进BV2细胞向促炎性M1表型极化，表现为iNOS（经典M1标志物）表达显著增加；相反，抗炎性、促修复M2表型标志物Arg-1的表达降低。100 μM白芷素治疗有效对抗了这些变化，显著抑制了向M1状态的转变，表现为iNOS表达降低和Arg-1表达同时增加。20 μM和40 μM白芷素组也表现出类似的iNOS表达降低和Arg-1表达升高。所有三个白芷素处理组均不同程度地降低了iNOS表达并增加了Arg-1表达，其中100 μM组效果最为显著。这表明白芷素不仅能减少小胶质细胞中的氧化应激，还能驱动其向更具保护性的抗炎表型转变。

白芷素挽救氧化应激损伤的NSPCs神经元分化潜能：功能恢复的关键步骤是NSPCs生成新神经元。在正常分化条件下，NSPCs有效分化为神经元，表现为神经元标志物TUJ-1的 robust 表达。然而，在分化过程中遭受H₂O₂诱导的氧化应激时，NSPCs的神经发生能力受到严重损害，导致TUJ-1⁺神经元数量显著减少，胶质纤维酸性蛋白（GFAP）⁺星形胶质细胞数量增加。值得注意的是，白芷素联合处理在很大程度上阻止了这一缺陷。100 μM白芷素处理组的TUJ-1⁺细胞比例显著高于单独H₂O₂组，且与对照组水平相当。H₂O₂暴露显著增加了GFAP阳性星形胶质细胞比例，而白芷素治疗逆转了这一效应。40 μM和100 μM白芷素均显著降低了GFAP阳性星形胶质细胞比例。这一关键发现表明，即使在恶劣的氧化环境中，白芷素仍能保护NSPCs的神经发生潜能。

白芷素在OGD/R条件下保持内皮细胞紧密连接蛋白表达并增强血管发生能力：为评价白芷素对内皮屏障完整性的保护作用，研究人员通过免疫荧光染色检测了关键紧密连接蛋白Claudin-5和闭锁小带蛋白-1（ZO-1）的表达。OGD/R暴露导致Claudin-5和ZO-1的平均荧光强度均显著降低。20、40和100 μM白芷素处理以剂量依赖性方式显著减弱了这一损失。特别是100 μM白芷素将Claudin-5和ZO-1表达恢复至与对照组相当的水平，表明其对缺血样损伤下的内皮连接复合物具有强保护作用。白芷素的促血管发生效应通过血管形成实验进行评估。OGD/R显著损害了内皮管腔形成，表现为总分支点、总环数和总分支长度减少。白芷素治疗显著逆转了这些缺陷。特别是在最高浓度（100 μM）时，白芷素将所有三个参数恢复至接近正常水平，提示其在OGD/R后促进血管网络恢复中的强效作用。

白芷素减轻OGD/R诱导的内皮高渗透性：为进一步研究白芷素对内皮屏障功能的功能性影响，研究人员进行了FITC-葡聚糖Transwell渗透性实验。OGD/R诱导了内皮单层FITC-葡聚糖转运的显著增加。白芷素治疗以剂量依赖性方式降低了这种高渗透性，40 μM和100 μM时观察到显著保护作用。100 μM白芷素组几乎将渗透性恢复至基线水平，凸显其在病理条件下维持内皮屏障完整性的功效。

讨论部分总结与结论翻译：

本研究为白芷素在模拟缺血性卒中环境中的多方面治疗潜力提供了有力证据。主要发现包括：白芷素能缓解氧化应激诱导的凋亡并支持NSPCs存活；减少小胶质细胞中的氧化应激并促进其从促炎性M1向抗炎性M2表型转变；以及关键性地挽救氧化应激条件下NSPCs受损的神经元分化能力。

卒中后大脑的特征是ROS激增，直接损害所有神经细胞类型。研究人员的数据显示H₂O₂诱导NSPCs产生ROS和凋亡，与这一观点一致，并强调了内源性干细胞库的脆弱性。白芷素清除ROS和促进NSPCs存活的疗效与其在心脏及其他模型中已知的抗氧化特性一致。通过保护这一再生细胞群，白芷素为任何后续修复过程奠定了基础。

主要由小胶质细胞调控的神经炎症是恢复的另一主要障碍。活化的M1小胶质细胞释放细胞毒性细胞因子，抑制神经发生并促进胶质瘢痕形成。研究人员观察到单独H₂O₂即可驱动BV2细胞向M1状态（iNOS⁺）转变并远离M2状态（Arg-1⁺），这凸显了氧化应激与炎症之间的相互作用。白芷素抑制M1标志物同时增强M2标志物的能力，证明了其强效的抗炎和免疫调节作用。将小胶质细胞平衡转向促修复表型，可能为神经再生创造更有利的分泌组。

本研究最重要的发现是白芷素通过克服氧化应激施加的分化阻碍直接促进神经发生。卒中后的恶劣微环境不仅杀死现有神经元，还阻止新神经元的诞生。研究人员观察到的NSPCs在H₂O₂应激下无法分化为神经元，模拟了体内神经发生往往中断或偏离神经元生成而偏向胶质生成的情况。白芷素恢复神经元分化的成功可能并非单一机制效应，而是其联合作用的后果：降低分化中NSPCs的整体氧化负担，以及通过调节小胶质细胞活化创造更有利的环境。这种双重作用使其成为特别有吸引力的候选药物，因其同时靶向两个核心病理通路。

研究结果表明，白芷素显著保持了关键紧密连接蛋白Claudin-5和ZO-1的表达，从而帮助维持内皮屏障的结构完整性。此外，白芷素增强血管发生能力，表现为管腔形成参数的恢复。功能上，这些结构和促血管发生益处与OGD/R诱导的高渗透性显著降低相结合。综合结果提示，白芷素通过巩固连接复合物、促进血管修复和减少血管渗漏，缓解缺血样损伤后血脑屏障功能障碍的关键方面。这些发现将白芷素定位为缺血性卒中的有前景治疗候选药物，值得进一步研究其潜在分子机制和体内疗效。

研究也存在一些局限性：首先，使用H₂O₂模拟氧化应激虽然有效且可重复，但不能完全重现缺血-再灌注的复杂代谢和炎症级联反应；其次，当前实验在单一培养体系中进行，NSPCs与小胶质细胞的共培养系统对于解析白芷素作用的细胞间相互作用和旁分泌机制将具有重要价值；最后，白芷素在神经细胞中的具体分子靶点，如与核因子E2相关因子2（Nrf2）抗氧化通路或Toll样受体4（TLR4）/髓样分化初级反应蛋白88（MyD88）/NF-κB炎症轴的潜在相互作用，仍有待阐明。

尽管存在这些局限性，研究人员的发现强烈地将白芷素定位为卒中治疗的有前景的促再生剂。其天然来源、已确立的安全性 profile 以及穿越血脑屏障的能力进一步增强了其转化潜力。

研究结论：总之，本研究表明天然化合物白芷素在体外缺血性损伤模型中有效对抗关键病理过程。它能缓解NSPCs中的氧化应激和凋亡，将小胶质细胞调节至抗炎表型，最重要的是保持NSPCs分化为神经元的关键能力。这些结果为白芷素作为促进缺血性卒中后内源性修复和恢复的新型治疗策略的进一步开发提供了有力的科学依据。未来工作将聚焦于在OGD/R和体内卒中模型中验证这些效应，并阐明所涉及的精确分子机制。