《Green Analytical Chemistry》：Benchmarking Green Analytical Methods for Phytoplankton Pigments Extraction and Quantification
浮游植物色素（包含叶绿素、类胡萝卜素和叶黄素）是评估水生生态系统生产力、生物多样性的关键生物标志物，也可用于验证卫星海洋水色产品。高效液相色谱(HPLC)凭借其灵敏度与分离度，仍是色素分析的参考方法，但传统工作流程依赖有机溶剂与高能耗操作，与可持续发展目标存在冲突。本研究采用多指标评估框架，系统评价了12种代表性浮游植物色素色谱分析方法的环保性能。研究结合分析生态标尺(ESA)、氯毒性(ChlorTox)、AGREE/AGREEprep、分析方法的绿色度评分(AMGS)、复合绿色分析程序指数(ComplexMoGAPI)、蓝色适用性等级指数(BAGI)及RGB 12等多种互补工具量化绿色度，覆盖溶剂毒性、能耗、废弃物产生与实际适用性维度。结果表明，分析方法正逐步向绿色化转型：超高效液相色谱(UPLC)方法在多指标中得分最高，化学危害更低，超临界流体色谱(SFC)紧随其后。当前SFC应用仍较少，且可定量化合物数量有限，但已展现出良好应用潜力。尽管已有改进，样品保存、质量保证所需的批量处理、过滤基提取等方法学限制，仍阻碍分析流程完全符合绿色分析化学(GAC)原则。不同评估框架间的权衡凸显了多指标评估的重要性：AGREEprep可详细反映样品前处理的能耗与废弃物情况，ChlorTox、BAGI与RGB 12则提供了互补视角。研究结果证明，整合更环保溶剂、UPLC与设计实验(DoE)策略，可同时优化环境可持续性与分析性能。未来方法开发与校准比对工作中采纳此类策略，将支持可靠的色素定量，同时使分析流程与联合国可持续发展目标及环境监测指令等可持续性目标保持一致。
1. 引言
浮游植物色素（含叶绿素、类胡萝卜素、叶黄素）是水生科学领域的核心生物标志物，广泛用于评估浮游植物生物量、解析群落组成。其中叶绿素-a是关键生物量指示物，被列为基本气候变量(ECV)，支撑海洋生产力及其对气候变化响应的评估。浮游植物色素定量分析是生态研究的基础，可用于重建群落结构、追踪生物多样性变化、验证海洋水色遥感产品，直接服务于《水框架指令》(WFD, 2000/60/EC)、《海洋战略框架指令》(MSFD, 2008/56/EC)等环境监测体系，同时也为联合国可持续发展目标(SDG)中的SDG 14（水下生物）、SDG 13（气候行动）提供数据支撑。
高效液相色谱(HPLC)因可实现高分类分辨率下的色素识别与定量，被公认为浮游植物色素分析的参考技术。但传统工作流程大量依赖丙酮、甲醇、乙腈等有机溶剂，这类溶剂存在毒性、挥发性与废弃物产生等环境与安全问题。尽管色谱效率提升与溶剂减量取得了渐进式改进，现有多数方法仍依赖有害化合物，与可持续目标不符。已有研究提出更快的液相色谱方法或优化提取流程，缩短了分析时间、部分降低了溶剂消耗，但仍使用传统有机溶剂，属于增量改进而非可持续性的变革性突破。超临界流体色谱(SFC)等替代技术目前在浮游植物色素分析中应用极少，且仅限于少数类胡萝卜素的定量，因此色素分析的环境足迹仍然显著。
长期大尺度浮游植物监测需求进一步放大了该问题——常规色素分析涉及大量溶剂消耗、能源使用与化学废弃物产生。绿色分析化学(GAC)为此提供了概念与方法框架，旨在不牺牲数据质量的前提下提升分析实践的可持续性，其核心12项原则涵盖减少溶剂消耗、使用更安全的试剂、降低能耗与最小化废弃物，可通过生命周期评估(LCA)、溶剂选择指南(SSG)等工具量化，并与《化学品注册、评估、许可和限制法规》(REACH)、SDG 12（负责任消费和生产）等监管框架对齐。当前浮游植物色素分析的方法开发多聚焦于分析效率与溶剂减量，对整体方法可持续性的综合评估仍十分有限，而浮游植物观测对气候变化评估与海洋生物多样性监测的重要性持续提升，填补这一缺口对确保支撑环境政策的分析方法本身符合可持续原则至关重要。
本研究系统评估了12种代表性浮游植物色素分析方法，包括8种传统色谱方法、3种近年开发的超高效液相色谱(UHPLC)方法，以及1种超临界流体色谱-超临界流体提取联用(SFC–SFE)方法，从环境可持续性与实际适用性双维度展开评价，评估工具覆盖分析生态标尺(ESA)、分析方法的绿色度评分(AMGS)、氯仿当量毒性评估标尺(ChlorTox)、绿色分析程序指数(GAPI)及其扩展版ComplexMoGAPI、分析绿色度指标(AGREE与AGREEprep)、蓝色适用性等级指数(BAGI)、RGB 12算法，通过标准化绿色度评估识别现有局限，指明更可持续的色素分析方法路径，最终支撑分析实践与SDG、WFD、MSFD等主流环境框架的对齐。
2. 综述范围与评估框架
2.1 文献筛选与数据源
浮游植物色素分析已发展出多种提取与分析技术，包括传统溶剂提取、超临界流体提取(SFE)、超声辅助提取(UAE)、加压液体提取(PLE)、微波辅助提取(MAE)、脉冲电场(PEF)、高压均质(HPH)、水力空化(HC)、天然深共晶溶剂(NaDES)等，这类技术在工业靶向高价值藻类化合物的场景中可缩短提取时间、提升效率、降低溶剂消耗，但迁移至环境浮游植物研究仍存在局限。二者的分析目标存在本质差异：工业方法针对高浓度生物质、靶向回收目标化合物，而环境监测需要处理低生物量、高度异质性样品，同时实现复杂色素混合物的同步定量，此外仪器成本、方法标准化、操作复杂度等限制也阻碍了新兴提取技术在常规生态工作流程中的应用。
生态监测中常用的分光光度法与荧光法仅能估算总叶绿素-a与总类胡萝卜素，选择性不足，无法实现色素的全面分离，不适用于需要浮游植物群落分类或化学分类学解读的场景，也不是卫星产品验证的金标准。因此本综述聚焦色谱方法——环境样品多色素测定的参考分析框架。目前已报道的浮游植物色素液相色谱方法超过30种，多数采用二极管阵列检测(DAD)，部分结合荧光检测，仅少数针对特定应用场景引入质谱。超高效液相色谱-质谱联用(UHPLC–MS)因灵敏度与选择性优势成为新兴方向，但在常规监测项目中的应用仍十分有限。
方法筛选以覆盖环境应用中的代表性分析策略为目标，而非穷举所有已发表方案，筛选标准包括：在浮游植物色素分析中已有成熟应用、适用于天然海水与浮游植物样品、通过SeaHARRE循环比对、HIPs方法比对等国际比对研究与校准验证、兼容通用色素分离策略、有溶剂减量、通量提升或绿色溶剂优化的方法学证据。筛选重点关注Zapata等、Van Heukelem与Thomas等已被广泛采纳的稳健色谱方案，后者还在ISO 17025:2008认可实验室中实施，体现了分析稳健性；同时纳入SCOR 78推荐方案、常规实验室操作流程、乙醇基等新兴绿色替代策略，最终形成包含12种方法的基准集，可对比常规与新兴浮游植物色素分析策略的分析性能、环境影响与可持续性。
2.2 分析限制与协调假设
环境浮游植物样品通常采集于玻璃纤维滤膜，低温保存后开展提取与色谱分析。由于环境监测多依赖野外调查或海洋科考采集的低生物量样品，分析方法需适配样品保存、延迟分析、船载基础设施有限等约束，这些特征将环境应用与基于高浓度藻类的工业工作流程区分开，也是评估分析方法实际适用性与可持续性的重要前提。
研究从文献中提取提取策略、色谱配置、溶剂体系、分析运行时间、整体工作流程等信息，为跨来源的可比性采用协调评估框架：所有色谱方法均在可比的环境样品基质、过滤流程、生物量范围与分析目标下评估，从“适用目的”视角出发，忽略部分方法在色素覆盖范围或特定化合物性能上的差异，将液相色谱法的目标色素数统一协调为约30种，仅SFC方法保留原始研究报道的实际定量色素数。
2.3 可持续性评估框架：绿色度与适用性指标
所选方法的比较采用基于互补GAC工具的多指标框架。单一指标无法覆盖分析可持续性的多维属性——其包含环境影响、化学危害、能耗、操作效率与实际适用性，且多数现有指标最初面向工业场景设计，并非专门针对科研或环境应用。多视角设计允许从互补的可持续性维度评估现有与未来的分析方法，避免被单一的“绿色度”定义束缚。该评估框架分为四类指标：危害与毒性导向指标、能源与资源导向指标、整体多准则GAC框架、适用性导向指标。其中ESA与ChlorTox主要量化环境与毒理负担；AMGS尤其适配色谱方法，明确计入溶剂消耗与仪器能耗这两大HPLC与UHPLC工作流程的环境足迹驱动因素；AGREE、AGREEprep与ComplexMoGAPI将多项GAC原则整合为统一的半定量框架，提供更系统的层面视角；GAPI系列工具可可视化分析全流程各阶段的环境影响；BAGI则从实际适用性维度补充评估稳健性、操作简便性与常规实验室的适配性。除GAC框架外，RGB 12模型延伸至白色分析化学(WAC)范式，整合环境可持续性（绿）、分析性能（红）、实际适用性（蓝），形成方法质量的统一多维概念，实现了从“仅看绿色度”到更均衡的分析可持续性定义的范式转变。
3. 色谱方法的可持续性比较评估
多指标评估显示，不同方法在不同可持续性维度上表现差异显著，各类指标并非冗余，而是分别凸显了化学危害、能耗、溶剂消耗、分析性能、操作适用性等不同侧面，因此结果更适合解读为多维可持续性评估，而非简单的“绿色/非绿色”排序。
溶剂初步分类为整个评估框架提供了毒理学与环境基线：乙醇与水因低毒性和可再生成分属性始终是最优溶剂体系，二甲基甲酰胺(DMF)与吡啶属于可持续性最差的溶剂，乙腈、甲醇、丙酮处于中间区间，反映了多数色谱工作流程仍在分析性能与环境负担间妥协的现状；SFC方法使用的超临界CO2因低毒性和低环境影响被列为绿色溶剂。
危害与毒性导向指标中，分析生态标尺(ESA)得分范围为47~81，UHPLC–MS/MS方法、乙醇基UHPLC方法得分最高，表明溶剂消耗减少与色谱效率提升降低了整体环境惩罚；两种传统HPLC方法得分最低，对应更高的有害溶剂使用量与更长的工作流程。氯仿当量总毒性(TotChlorTox)范围为3.69~28.62，同样由UHPLC–MS/MS方法取得最低毒性值，传统HPLC方法毒性值普遍超过25，UHPLC与含乙醇工作流程的毒理影响显著降低。但这类差异不能简单解读为绿色分析化学的严格时序进步——所评估方法的开发周期与技术背景不同，分析目标（色素覆盖范围、检测系统、灵敏度要求、操作场景）也存在差异，更高的可持续性得分更可能反映的是色谱效率、微型化、仪器技术的整体进步，而非单纯刻意的绿色设计策略。
能源与资源消耗维度的AMGS指标（范围3.5~37）补充了流程导向的视角，清晰区分了传统HPLC与新型UHPLC配置：运行时间短、流动相消耗量低的方法AMGS值显著更低，UHPLC–MS/MS与另一UHPLC方法表现最优，传统HPLC方法AMGS值常超过30。所有方法的仪器能耗仍处于较高水平，这是色谱分离、冷藏样品保存、溶剂输送系统、质量控制流程的固有需求，但UHPLC通常通过更快的分析速度与更低的溶剂消耗降低整体能耗；SFC方法则主要通过减少有机溶剂消耗获得较低的AMGS值。结果表明色谱工作流程的可持续性提升与分析微型化、运行时间优化高度相关，无论方法开发阶段是否将可持续性作为明确的设计目标。
整体GAC框架中，AGREE得分在方法间差异适中（0.56~0.67），乙醇基UHPLC方法对GAC原则的整体合规性最高；而所有方法的AGREEprep得分均较低（0.23~0.47），凸显样品前处理是浮游植物色素分析中可持续性最低的环节，这对应着环境监测中不可避免的约束：低生物量样品过滤、冷藏存储、溶剂提取、多次操作步骤。ComplexMoGAPI进一步说明色谱效率的提升并不等同于工作流程完全可持续，UHPLC与SFC方法虽减少了溶剂消耗与分析运行时间，但若提取流程复杂、前处理要求高，整体工作流程可持续性仍可能偏低。这类工具共同证明，分析可持续性取决于提取、色谱分离、分析通量、废弃物产生在整个流程中的交互作用，而非仅靠替换溶剂实现。
适用性与白色分析化学视角的评估显示，传统色谱方法的BAGI得分差异较小（72.5~87.5），说明多数被评估方法在操作上仍具备稳健性，适配常规实验室应用；SFC、UHPLC–MS/MS等配置更复杂的方案BAGI得分更低，反映出仪器复杂度提升、常规监测实验室可及性下降的特点。RGB12框架提供了最整合的视角，在WAC范式下同时纳入环境影响（绿）、分析性能（红）、适用性（蓝）。其中SFC–SFE方法的绿色度组分得分最高，体现了超临界流体技术与有机溶剂量减少的环境优势，但该方法的适用性与样品前处理性能较低，反映出当前SFC基色素分析在常规生态监测中的局限性。UHPLC–MS/MS方法取得了最高的整体白度得分，代表环境可持续性、分析性能与适用性的最佳平衡；乙醇基UHPLC方法在RGB12框架下也表现优异，支持将更绿色溶剂体系与高效色谱平台结合的应用潜力。整体而言，没有单一分析方法能同时优化所有可持续性维度：环境性能优异的方法可能在分析覆盖范围或操作可行性上存在局限，而高度稳健的常规方法可能仍背负较高的环境负担。
4. 讨论：浮游植物色素分析中的可持续性权衡
多指标整合评估表明，浮游植物色素分析的可持续性是内在多维的属性，单一绿色度指标无法充分描述，不同分析策略在一个由毒理负担、能耗、分析稳健性、溶剂消耗、操作适用性共同定义的更广阔的可持续性空间中占据不同位置。
最清晰的结论是UHPLC基工作流程的整体可持续性表现更优，这类方法在多数指标中受益于溶剂消耗减少、运行时间缩短与色谱效率提升。但这一差异需谨慎解读：被评估方法的开发初衷、技术背景、仪器平台存在差异，涵盖色素覆盖范围、检测器配置、灵敏度要求的不同，因此更高的可持续性得分不一定代表绿色分析化学的严格时序演进，而是技术进步、色谱微型化、分析效率提升的综合结果。这一区分对理解传统HPLC方法尤为重要——这类方法大多是在当时的技术约束下为实现最大色素分辨率与稳健性而设计的，更新的工作流程则受益于色谱柱技术、检测器灵敏度、溶剂输送系统、软件优化的进步，间接通过降低溶剂通量与分析运行时间减少了环境负担。
溶剂选择始终是跨指标影响可持续性的主导因素：乙醇基方法因毒性相对较低且具备部分可再生属性，始终表现出更低的毒理负担与更优的绿色度特征；而高度依赖乙腈、DMF或吡啶的溶剂体系会显著降低可持续性表现。但仅靠替换溶剂不足以实现整体可持续性提升：部分毒性特征友好的方法仍存在高能耗或更复杂的样品前处理流程，体现出不同可持续性维度间的权衡。
评估同时凸显了浮游植物环境监测中持续存在的结构性约束：与基于高浓度藻类的工业应用不同，环境研究依赖低生物量样品过滤、冷藏存储、批量处理、广泛的质量控制流程，这些需求固有地提升了能耗与样品处理复杂度，限制了分析方法对绿色分析化学原则的完全合规，所有方法普遍中等或偏低的AGREEprep得分正是这类不可避免的操作约束的直接体现。
超临界流体方法是极具潜力的未来方向，因其减少了对有害有机溶剂的依赖，且在RGB12框架中绿色度表现优异。但当前SFC方法仍受限于色素覆盖范围窄、方法学复杂度高、常规监测实验室适用性低的问题，现阶段应被视为补充性或新兴技术，而非传统液相色谱工作流程的直接替代方案。
本研究的重要贡献在于证明了不同绿色度指标的互补性：危害导向方法主要捕捉溶剂毒性，AMGS强调流程效率与色谱资源需求，AGREE系列工具评估对GAC原则的合规性，RGB12则将分析质量与适用性整合到更广阔的WAC框架中。这类指标的组合为评估现有与未来的分析方法提供了更稳健、可迁移的框架，尤其适配未来发展方向——更绿色的溶剂、自动化提取系统、微型化液相色谱平台、改进的SFC技术等可能同时或选择性地优化不同的可持续性维度，本研究采用的框架可在不局限于单一绿色度定义的前提下，对这些新方法开展多视角的可持续性比较。
总体而言，最具前景的可持续浮游植物色素分析路径是：结合更绿色的溶剂体系、缩短分析运行时间、采用高效色谱平台，同时保留生态监测与卫星验证应用所需的分析稳健性。
5. 结论
本研究采用多指标方法评估了浮游植物色素分析方法的绿色度，涵盖分析生态标尺(ESA)、氯毒性(ChlorTox)、AGREE、AGREEprep、蓝色适用性等级指数(BAGI)、RGB12等工具，实现了对支撑海洋学研究与卫星数据验证的各方法的环境、分析与操作性能的全面互补性评估。
结果并未显示出随时间推移的严格绿色分析方法递进，而是呈现出由每种方法的技术可得性、分析范围、应用目标差异驱动的可持续性表现分布。近期开发的两种方法在RGB12、AGREE、ComplexMoGAPI等多指标中表现最优，同时氯毒性(ChlorTox)评估显示其化学危害低、分析生态标尺(ESA)得分高；另两种UPLC基方法与SFC–SFE方法紧随其后，体现了UPLC基方法与SFC、SFE等替代绿色技术的逐步采纳。但这些差异更适合解读为仪器技术进步（如UHPLC微型化、检测器灵敏度提升）、溶剂选择策略演变、分析需求变化共同作用的结果，而非可持续性设计的单向时序改进，整体反映出分析工作流程在方法目标与技术背景约束下，逐步向可持续性与分析性能更好平衡的方向发展。
尽管取得了上述进展，固有的方法学约束仍阻碍了对绿色分析化学原则的完全合规：极低温度保存、过滤基样品采集与后续的溶剂提取固有地增加了能耗与试剂消耗；质量保证所需的批量处理（包括空白与校准标准品）对分析可靠性不可或缺，但也提升了总处理时间与操作复杂度。分光光度法与荧光法等替代技术因分辨率有限、色素覆盖范围不全，尤其是针对复杂自然群落时，无法完全替代HPLC/UHPLC。
不同GAC评估框架间也存在明显的权衡：优化低毒性与溶剂消耗的方法可能产生更高的能耗或更复杂的前处理步骤，而高仪器效率的方法未必在所有可持续性指标上表现最优。AGREEprep可详细反映样品前处理的影响（包括能耗与废弃物产生），AGREE评估对绿色分析原则的整体依从性但未充分覆盖前处理负担；ChlorTox聚焦试剂（尤其是溶剂）的化学危害，但不考虑能耗或分析工作流程效率；BAGI评估方法的实际可行性与适用性，但本研究中因多数色谱方法操作设计相似，区分度有限；RGB12则整合了环境、分析与操作维度，支持更整体的跨方法比较。这类工具强调的是互补而非可互换的视角，强化了定义更绿色分析策略时需要多指标评估的必要性。
未来建议在浮游植物色素分析规程制定、方法开发与校准比对工作中纳入绿色评估框架，优先选用乙醇、乙酸乙酯等更绿色溶剂，探索天然深共晶溶剂(NaDES)的潜力，采纳UPLC基与SFC基技术，应用设计实验(DoE)策略同步优化溶剂消耗、提取效率与运行时间。已证实可用于色素分析的超临界流体提取-超临界流体色谱联用技术，应进一步优化以适配海洋调查的常规实施。
在方法开发阶段同时考量绿色度与白度，可确保分析流程不仅环境可持续，同时具备稳健性、可比性，适配高质量色素定量需求，最终支撑负责任、标准化的海洋学研究实践。
