TPPU通过抑制海人酸(KA)诱导的惊厥小鼠Akt/mTOR信号通路发挥抗惊厥及缓解惊厥相关共患病的作用

《Frontiers in Immunology》：TPPU protects against seizures and seizure-associated comorbidities by inhibiting the Akt/mTOR signaling pathway in KA-induced convulsant mice

　　

背景：癫痫与其相关共患病之间存在共同的病理生理机制，其中神经炎症起关键作用。1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)脲(TPPU)是一种可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)抑制剂，可通过阻止环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)水解发挥强效广谱抗炎作用，但其潜在抗癫痫及缓解共患病效应及相关分子机制尚待阐明。方法：研究人员采用脑电图(EEG)记录和Racine评分监测惊厥；通过行为学测试评估KA诱导慢性癫痫小鼠模型的惊厥相关认知及焦虑样共患病；全细胞膜片钳记录评估突触功能；RNA测序阐释TPPU神经保护作用的分子机制。结果：行为学评估、EEG监测及全细胞膜片钳记录显示，TPPU可显著减轻KA诱导慢性癫痫小鼠的惊厥严重程度及焦虑/抑郁样行为，并增强认知功能；TPPU通过减少神经元凋亡和神经炎症表现出神经保护作用。Bulk RNA测序分析表明TPPU在癫痫发生过程中抵御神经炎症。机制研究发现TPPU抑制Akt/mTOR通路激活。结论：研究结果表明Akt/mTOR轴是TPPU对抗小鼠癫痫及其共患病保护作用的关键介导通路。该研究不仅推进了对癫痫病理生理的理解，也为开发全面治疗策略提供了新靶点。

论文解读：TPPU通过抑制KA诱导惊厥小鼠Akt/mTOR信号通路拮抗癫痫及共患病

本文发表于《Frontiers in Immunology》。癫痫是以脑内异常同步化神经元放电为特征的慢性神经系统疾病，全球患者约5000万，除发作外常伴焦虑、抑郁、认知障碍等神经精神共患病。现有证据表明神经炎症是癫痫及其共患病的共同核心病理机制，靶向神经炎症有望成为疾病修饰治疗的新方向。可溶性环氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase, sEH)可降解具有神经保护及抗炎作用的环氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids, EETs)，其抑制剂TPPU(1-三氟甲氧基苯基-3-(1-丙酰哌啶-4-基)脲)在阿尔茨海默病、焦虑抑郁及神经痛模型中已显示神经保护潜力，但在癫痫及共患病中的作用与机制尚不明确。本研究以KA(海人酸,kainic acid)诱导的C57BL/6小鼠急性及慢性癫痫模型为对象，探讨sEH抑制剂TPPU对癫痫发作、神经精神共患病的干预效应，并从胶质细胞活化、神经炎症及Akt/mTOR信号通路层面阐明分子机制。

研究人员主要采用以下关键技术方法：建立KA诱导的C57BL/6小鼠急性(预处理TPPU 3天+造模后继续给药7天)及慢性癫痫模型(预处理TPPU 7天+造模后继续给药28天)，设对照+生理盐水(Ctrl+NS)、KA+生理盐水(KA+NS)、KA+TPPU(KA+TPPU)组；通过脑电图(Electroencephalogram, EEG)记录痫样放电、Racine评分评估惊厥严重度；进行新位置识别(Novel Location Recognition, NLR)、黑白箱、高架十字迷宫(Elevated Plus Maze, EPM)、莫里斯水迷宫(Morris Water Maze, MWM)等行为学测试评价认知与焦虑样共患病；全细胞膜片钳记录皮质神经元动作电位及微小兴奋性/抑制性突触后电流(miniature Excitatory/Inhibitory Postsynaptic Currents, mEPSC/mIPSC)；TUNEL染色联合NeuN免疫荧光检测神经元凋亡；免疫荧光观察GFAP⁺星形胶质细胞及Iba1⁺/CD68⁺小胶质细胞活化；Western blot检测p-Akt(Ser473)/Akt、p-mTOR(Ser2448)/mTOR及胶质标记物；原代皮质神经元、星形胶质细胞及小胶质细胞体外KA±TPPU处理验证；ELISA检测皮层及海马14,15-EET与14,15-DHET水平；Bulk RNA测序(RNA-sequencing)结合加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA)、GO与KEGG富集及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)解析差异表达基因与通路；qRT-PCR检测炎性因子及A1/A2型星形胶质细胞标记mRNA。

TPPU administration significantly reduces seizure severity and mitigates the associated comorbidities in a kainic acid (KA)-induced chronic epileptic mouse model

研究人员发现TPPU预处理及持续给药可显著降低KA慢性癫痫小鼠Racine评分，EEG显示痫样放电频率减少、棘波幅度降低；行为学上，TPPU恢复NLR辨别指数，增加黑白箱中明室停留时间及EPM开放臂进入时间与次数，缩短MWM逃逸潜伏期并增加目标平台穿越次数(游泳速度无组间差异)，表明TPPU减轻惊厥严重程度并改善焦虑样行为与空间认知缺陷。

TPPU administration reduces neuronal apoptosis and improves synaptic function in a KA-induced chronic epileptic mouse model

TUNEL/NeuN双标显示KA组皮质及海马CA3区凋亡神经元增多，TPPU处理显著减少TUNEL⁺神经元并趋向恢复抗凋亡蛋白Bcl-2表达。全细胞膜片钳示KA组神经元动作电位发放频率降低、mEPSC频率与幅值下降，而mIPSC无显著改变；TPPU处理使动作电位发放及mEPSC频率与幅值恢复接近对照组，证实TPPU减轻神经元凋亡并选择性修复兴奋性突触传递功能。

TPPU treatment significantly attenuates glial activation and neuroinflammation in chronic epileptic mice

RNA-seq热图及GO分析显示KA上调免疫/炎症反应及胶质活化相关基因，TPPU显著逆转此趋势；GSEA示钙信号通路及炎症调节基因集在KA组富集而被TPPU抑制。免疫荧光确认sEH主要表达于癫痫后GFAP⁺星形胶质细胞而非神经元或小胶质细胞，KA组GFAP⁺星形胶质细胞数及sEH/GFAP共定位升高，TPPU降至近对照水平；ELISA显示TPPU升高皮质及海马14,15-EET、降低14,15-DHET。Iba1⁺小胶质密度及Iba1⁺CD68⁺活化小胶质比例在KA组升高，TPPU降低之；Western blot示CSF1R在KA海马升高并被TPPU回调。体外原代星形胶质细胞实验中，TPPU下调KA诱导的A1毒性星形胶质细胞标记(Srgn、Serping、Ugt1a1、Ggta1、H2t23) mRNA，上调A2保护性标记(Ptx3、Cd14)。qRT-PCR示KA组皮质及海马促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-6升高，TPPU抑制之；抗炎因子TGF-β被TPPU恢复，IL-4趋高。综上，TPPU抑制癫痫后星形胶质细胞活化与A1极化、抑制小胶质活化，重塑炎症微环境。

TPPU protects against neuroinflammation by inhibiting the Akt/mTOR signaling pathway in astrocytes

WGCNA示最显著富集PI3K-Akt信号的青绿色模块及特异性富集mTOR信号(mammalian Target Of Rapamycin signaling pathway)的黑色模块；体内外Western blot显示KA诱导原代星形胶质细胞及小鼠海马p-Akt(Ser473)/Akt与p-mTOR(Ser2448)/mTOR比值升高，TPPU处理显著抑制其磷酸化。表明TPPU通过抑制星形胶质细胞中Akt/mTOR通路活化发挥神经抗炎保护作用。

讨论与结论总结

讨论指出癫痫共患病与癫痫共享神经炎症机制，sEH主要在癫痫后星形胶质细胞上调并促进EET水解为促炎14,15-DHET；TPPU抑制sEH活性、维持EET水平，减少星形胶质细胞活化与A1极化并促进A2表型，同时抑制小胶质活化，重建胶质稳态。Akt/mTOR通路过度激活见于多种癫痫模型且与神经元兴奋性增高及炎症相关，本研究首次在KA慢性癫痫模型中证实TPPU抑制星形胶质细胞Akt/mTOR通路活化，从而减轻神经炎症、神经元凋亡及突触功能障碍，实现抗惊厥及共患病缓解的双重效应。作者也指出研究局限含未设单纯TPPU对照组、未验证已成型慢性癫痫的治疗效果、缺乏Akt/mTOR通路的干涉验证实验及Vehicle对照组不完全。

结论翻译：本研究结果确立Akt/mTOR轴是TPPU在小鼠模型中对抗癫痫及其共患病保护作用的关键介导通路。该工作不仅增进了我们对癫痫病理生理学的理解，也为开发综合性治疗新策略识别了新颖靶点。