《Food Control》：Identification of microbial hotspots and biofilm-forming bacteria in a high output industrial cheese plant: Comparative evaluation of enzymatic versus sodium hydroxide-based cleaning-in-place (CIP) for biofilm removal
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有效的清洁与消毒对于控制干酪生产中的微生物污染和防止生物膜形成至关重要。研究人员采用多步骤方法，评估了一家年产约40,000吨切达干酪的工业化工厂中微生物的持久性及原位清洗（CIP）策略。研究人员通过平板计数和高通量测序（16S rRNA扩增子测序和鸟枪法测序
有效的清洁与消毒对于控制干酪生产中的微生物污染和防止生物膜形成至关重要。研究人员采用多步骤方法，评估了一家年产约40,000吨切达干酪的工业化工厂中微生物的持久性及原位清洗（CIP）策略。研究人员通过平板计数和高通量测序（16S rRNA扩增子测序和鸟枪法测序）分析CIP前后的环境拭子样本，以识别微生物热点区域。传统CIP在总体上有效，但在Alfomatic堰（Alfomatic weir）、凝块分配罐（CDT）和块成型机（block formers）等关键区域仍存在残留污染。工业化规模试验比较了碱性和酸性CIP与酶法替代方案，结果显示传统CIP后实现了完全的微生物清除，而酶法CIP在一个位点留下了脱氧核糖核酸（DNA）特征，但未检测到可培养细胞。测序鉴定荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）为优势非发酵剂细菌，提示可能存在生物膜形成。平行的实验室规模研究利用CDC生物膜反应器（CDC Biofilm Reactor?）结合扫描电子显微镜（SEM）比较了碱性和酶法CIP对P. fluorescens生物膜的去除效果。碱处理完全去除了生物膜基质但留下了附着细胞，而酶处理降解了基质但显示了残留的基质片段和附着细胞。平板计数证实了残留生物膜群体之间的显著差异，碱、酶合剂和蛋白酶处理后平均分别降低了3.75 log、2.56 log和1.87 log（p < 0.0001），凸显了这些方法的不完全性。碱法CIP可改善微生物减灭效果，而酶可破坏生物膜基质。然而，两者单独均无法实现完全去除，这支持采用联合策略以提高乳制品加工中的清洁效率和可持续性。
该研究发表于《Food Control》，旨在系统评估工业化干酪加工环境中微生物污染 persist 的分布特征及生物膜形成的内在机制，并比较传统化学CIP与酶法CIP的效能差异，为开发更高效、可持续的清洁策略提供依据。
干酪作为全球重要的乳制品，其安全生产依赖于严格的微生物控制。然而，连续化工业生产过程中，微生物在设备表面附着并形成生物膜（biofilm）成为持续性污染源。生物膜是由微生物胞外聚合物（EPS）构成的保护性基质，能够屏蔽杀菌剂渗透，使内部微生物对消毒处理的抵抗力显著增强。其中，荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）作为典型的嗜冷菌（psychrotroph），可在低温下分泌热稳定的蛋白酶和脂肪酶，导致干酪在贮藏期间发生感官劣变，且其生物膜可腐蚀不锈钢管道并促进食源性病原菌定植。传统CIP通常采用氢氧化钠（NaOH）等碱性清洗剂结合酸洗，虽能有效降低微生物负荷，但存在能耗高、水耗大、废液排放多等问题，且对成熟生物膜的清除效果有限。酶法CIP因其底物特异性、生物降解性好及低能耗等优势受到关注，但其在工业化场景中的实际效果尚缺乏系统验证。基于此，研究人员开展了多尺度整合研究，以明确微生物污染热点、优势生物膜形成菌，并对比评价碱法与酶法CIP的效能。
研究人员采用的关键技术方法包括：在爱尔兰某工业化切达干酪厂进行多时点环境采样（2021年10月、2022年10月及2024年2月），覆盖Alfomatic干酪制作设备、凝块分配罐（CDT）及块成型机等关键位点；结合传统平板计数（标准平板计数SPC、耐热菌计数及肠杆菌科计数）与16S rRNA扩增子测序、鸟枪法宏基因组测序进行微生物群落分析；在2024年2月开展工业化规模对比试验，分别实施传统CIP（碱-酸序列）与改良酶法CIP（轻度碱洗后接蛋白酶Memzyme处理）；以P. fluorescens DPC6056为模式菌株，在CDC生物膜反应器（CDC Biofilm Reactor?）中于304不锈钢（SS）试片上培养72小时生物膜，分别采用1%碱清洗剂（75 °C，30 min）、0.05%生物膜酶合剂（WTL-10）及0.1%蛋白酶（Memzyme，均为50 °C，30 min）进行CIP处理，通过扫描电子显微镜（SEM）观察生物膜结构变化，并以平板计数量化各处理组对数减少值；运用方差分析（ANOVA）及Tukey事后检验进行统计学分析。
研究结果部分：
3.1 CIP前后干酪厂微生物的分离与鉴定
研究人员通过2021年和2022年两个生产季末的环境采样，系统描绘了工业化干酪厂的微生物分布图谱。平板计数结果显示，Alfomatic堰、Alfomatic顶部转向处及CDT的嗜温好氧菌（mesophilic aerobic bacteria）负荷最高，分别为7.4、6.7和7.4 log
10 CFU/拭子（2021年）。CIP后多数位点微生物显著降低，但Alfomatic堰（4.2 log10 CFU/拭子，2022年）、CDT（2.2 log10 CFU/拭子，2021年）及块成型机推料门（6.5 log10 CFU/拭子，2022年）仍存在残留，后者甚至出现较CIP前的反常升高，提示存在清洁死角、芽孢萌发或生物膜保护效应。16S rRNA扩增子测序揭示，除预期的发酵剂菌属乳球菌属（Lactococcus）和链球菌属（Streptococcus）外，假单胞菌属（Pseudomonas）几乎遍布全厂，不动杆菌属（Acinetobacter）也在部分位点检出。2022年分离培养的鸟枪法测序进一步鉴定出霍氏肠杆菌（Enterobacter hormaechei）、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）等多种CIP后存活菌，尤其集中于块成型机区域，提示CIP可能促使生物膜碎片移位再定植。
3.2 工业化规模酶法CIP与传统化学CIP的比较
基于前两轮采样确定的高风险位点，研究人员于2024年2月实施了酶法与传统CIP的对比试验。酶法CIP流程包括2%轻度碱洗（60 °C，20 min）、水洗及0.02%蛋白酶Memzyme循环（50 °C，60 min）；传统CIP则为标准碱-酸序列处理。结果显示：CIP前各采样位点均可检出活菌及DNA；酶法CIP后所有位点均未检出可培养细菌，但Alfomatic堰残留微量DNA（26,000对读数）；传统CIP后则所有位点均未检出活菌及DNA。该结果表明两种CIP体系对活菌均有强效清除作用，但酶法处理未能完全去除核酸残留，可能源于生物膜瓦解后释放的DNA片段或存活但不可培养（VBNC）状态细菌的存在。
3.3 鸟枪法宏基因组测序鉴定潜在生物膜形成菌
对8份DNA可检出样本的鸟枪法测序显示，微生物群落以链球菌属（主要为嗜热链球菌Streptococcus thermophilus）、乳球菌属（Lactococcus lactis）和乳杆菌属（Lactobacillus）等发酵剂菌属为主，但假单胞菌属作为环境污染物呈高丰度分布。特别值得注意的是，酶处理后的Alfomatic堰样本中，假单胞菌属占比超过98%，且α多样性（Shannon's H指数）急剧下降，表明酶处理虽大幅降解了总体微生物多样性，但假单胞菌可能以生物膜形式持久存活。物种水平分析确认P. fluorescens为最优势种，提示其为核心生物膜形成菌。
3.4 P. fluorescens在不锈钢表面生物膜形成及其CIP处理的分析
SEM观察显示，未经处理的304不锈钢试片表面形成致密成熟的生物膜，EPS广泛覆盖且细菌细胞深埋其中。三种CIP处理后，碱处理导致生物膜结构显著破坏，可见细胞皱缩；两种酶处理（蛋白酶及生物膜酶合剂）均能有效降解EPS层，使杆状细菌细胞完全暴露，但伴随残留细胞碎片。平板计数证实了SEM的定性观察：碱处理组生物膜减少量最高，平均达3.75 ± 0.03 log10；生物膜酶合剂组为2.56 ± 0.07 log10；蛋白酶组为1.87 ± 0.05 log10，三组间差异具有统计学意义（p < 0.001）。该结果定量表明，碱法CIP对存活细胞的减灭效果最优，但三种处理均未能实现生物膜的完全根除。
讨论部分总结：
研究人员通过整合工业化环境采样与实验室机制研究，揭示了干酪加工环境中微生物污染的空间异质性及其生物膜介导的持久性机制。Alfomatic堰、CDT及块成型机被确认为关键污染热点，其中P. fluorescens作为优势非发酵剂嗜冷菌，其生物膜形成能力是造成CIP后残留污染的核心因素。工业化试验中，酶法CIP虽能达到与碱法CIP相当的活菌清除效果，但微量DNA的残留提示其可能存在生物膜瓦解不完全或VBNC状态细菌的隐患。实验室层面的CDC生物膜反应器研究进一步量化了不同处理的功效差异，并阐明碱处理侧重于通过皂化和蛋白质变性作用剥离有机质及破坏生物膜结构，而酶处理则通过特异性降解EPS中的蛋白质、多糖及脂质组分来瓦解基质屏障。两者的局限性均在于无法完全去除强附着细胞，因此需配合后续消毒步骤以实现完全灭活。
研究人员提出，未来的清洁策略应向"混合模式"转型：日常采用低浓度、低温碱洗维持基础卫生水平，周期性嵌入酶法干预以靶向降解EPS和打断生物膜定植周期。这种交替方案有望在保证微生物安全的前提下，降低化学负荷与能源消耗，提升干酪生产的可持续性。该研究通过工业观测与实验室验证的闭环设计，为乳制品加工行业的清洁工艺优化提供了实证基础和可操作路径。
研究结论：
该研究表明，尽管传统的碱性和酸性CIP体系在工业化干酪设施的大多数区域仍能有效降低微生物负荷，但Alfomatic堰、CDT和块成型机等持久性热点区域仍存在生物膜相关污染的持续风险。鸟枪法宏基因组测序证实了P. fluorescens与发酵剂相关物种的共同主导，提示生物膜形成是这种持久性的潜在机制。实验室规模的深入研究进一步揭示，无论是碱处理还是酶处理，单独使用时均无法实现生物膜的完全根除，两者均残留有附着细胞。然而，酶法清洗通过靶向EPS降解及可持续性优势，展现出区别于传统高温碱清洗的独特价值。研究人员的发现表明，酶法CIP具有部分替代碱清洗的潜力；将酶法作用与降低强度的碱清洗及额外消毒步骤相结合，乳制品加工企业可以在降低运营成本和环境影响的同时，实现更完整的生物膜控制。为平衡微生物安全与可持续性，可考虑采用混合清洁策略：日常CIP循环中使用较低浓度的碱清洗剂并在较低温度下运行，足以维持基础卫生并防止积垢；而周期性的酶法干预（例如每周一次）则可靶向降解EPS，打断开始定植的生物膜。这种交替方案可以减少日常高温碱清洗的化学和能源负担，同时确保残留生物膜结构得到周期性降解。重要的是，这种整合方式不会损害微生物安全，因为酶循环是对碱清洗的补充，确保实现有效的长期生物膜管理。通过将工业化规模观测与受控实验室生物膜模型相结合，该研究为微生物持久性提供了机制性见解，并验证了酶法CIP作为传统清洗可持续增强手段的作用。总体而言，这些发现凸显了采用整合清洁策略的重要性，即结合酶法和碱法清洗并附加消毒步骤，以确保实现完全微生物灭活。实施这种组合策略可以提升产品安全性、降低腐败风险，并改善干酪制造操作的整体可持续性。
