通过结合连续稀释培养与长读长测序对绞碎牛肉中的产志贺毒素大肠杆菌活菌进行计数与基因组鉴定

《Pathogens》：Enumeration and Genomic Confirmation of Viable Shiga-Toxin-Producing Escherichia coli from Ground Beef by Integrating Serial Plating with Long-Read Sequencing

　　

食用被产志贺毒素大肠杆菌（Shiga toxin-producing *Escherichia coli*, STEC）污染的食品每年在美国导致数千人患病。长读长测序（long-read sequencing）可缩短食品中STEC检测所需时间，但测序不具备定量能力，且无法区分活菌与死菌。因此，本研究探究将连续稀释培养与长读长测序相结合，以仅对样品中的活菌STEC进行定量。研究人员将STEC接种至绞碎牛肉中，使用 stomacher（均质器）进行均质化处理。液体经滤过去除真核细胞后离心收集菌体沉淀。对沉淀进行连续稀释后涂布于选择性琼脂平板上，随后对单菌落进行测序。初步实验发现，在室温条件下处理样品会导致STEC水平较初始接种浓度增加约1个数量级，干扰了精确计数。在后续实验中，样品与试剂均保持低温处理，STEC回收量与接种量之间无显著差异。从单个菌落提取的DNA可提供充足数据，多次鉴定出所有感兴趣的毒力基因。样品中STEC含量可定量至1 cfu g^?1的检测限。利用该方法对食品样品中的STEC进行定量，将有助于改进风险评估并指导行业中的风险缓解措施。

本研究围绕食品中致病菌检测这一食品安全领域的核心议题展开。产志贺毒素大肠杆菌（STEC）是重要的食源性病原体，每年在美国造成大量感染病例，其中O157:H7血清型最为常见。美国农业部食品安全检验局（USDA FSIS）规定，绞碎牛肉中若检出携带*stx*、*eae*、*espK*、*espV*基因及七种特定O抗原之一的STEC，即判定为"掺假"。现有检测方法主要依赖培养结合分子生物学方法，耗时至少四天，且需经过增菌步骤，无法实现精确定量。长读长测序技术（以牛津纳米孔技术为代表）虽能实现数小时内的快速检测，但面临两大瓶颈：一是食品基质中大量宿主DNA会竞争性占据测序孔道，导致病原体基因检出率低；二是无法区分活菌与死菌，可能因检出死菌DNA而产生假阳性，引发不必要的食品召回和经济损失。因此，建立一种既能保持培养法活菌选择性、又能实现精确定量且克服宿主DNA干扰的新型检测方法，成为食品安全检测领域亟待解决的问题。

基于此背景，研究人员提出将连续稀释涂布培养与长读长测序整合的工作流程，旨在同时实现STEC的计数与鉴定。研究首先通过小规模实验评估室温处理对细菌回收的影响，进而优化为全程低温操作，最终开展大规模实验验证方法的灵敏度与可靠性，并在《Pathogens》期刊发表了相关成果。研究结论表明，该方法成功建立了集活菌计数与全基因组鉴定于一体的食品病原菌检测新范式，为解决现有技术瓶颈提供了可行方案。

本研究采用的关键技术方法涵盖以下核心环节：样本前处理采用均质-过滤-离心组合策略，使用加装2% D-山梨醇改良胰蛋白胨大豆肉汤（mTSB）的过滤袋对绞碎牛肉样本进行stomacher均质，依次通过60 μm和20 μm滤膜去除真核细胞，再经差速离心（130×g和13,000×g）富集细菌；活菌选择性分离采用山梨醇麦康凯琼脂（SMAC）筛选不发酵山梨醇的典型菌落；单菌落长读长测序采用牛津纳米孔技术Rapid Barcoding试剂盒制备文库，在GridION设备上使用R10.4.1流动池测序20小时；生物信息学分析基于Galaxy平台，使用Porechop去除接头、Fastp质控、Nanoplot评估数据质量，并通过NCBI BLAST比对分析11个靶标基因（*fliC*、*eae*、*rrsC*、*stx1A*、*stx1B*、*stx2A*、*stx2B*、*wzx*、*wzy*、*espK*、*espV*）的检出情况。样本队列为实验室人工接种STEC O157:H7（ATCC 43895）的绞碎牛肉，设置了包括培养基对照、无肉阳性对照、未接种肉对照及梯度接种（10⁰–10³ cfu g^?1）处理组。

研究结果部分包含以下三个实验及其发现。

**小规模实验** 研究人员将E. coli O157:H7接种至绞碎牛肉，浓度范围为10⁰至10³ cfu g^?1。培养基对照和未接种肉对照均未检出E. coli。然而，平板计数显示回收的E. coli数量显著高于（p < 0.05）接种量，多数样品出现约1个数量级的增长。从各浓度SMAC平板选取菌落提取DNA并进行测序，每个菌落平均产生0.52 Gb测序数据。所有11个感兴趣基因（*fliC*、*eae*、*rrsC*、*stx1A*、*stx1B*、*stx2A*、*stx2B*、*wzx*、*wzy*、*espK*、*espV*）在所有样品中平均被检出168次，表明单菌落DNA足以支持多靶标基因的可靠鉴定。

**低温样品实验** 鉴于小规模实验中观察到的细菌数量异常增长，研究人员推测室温处理（约21 °C）期间发生了细菌增殖。因此设计低温处理实验：稀释液预冷、样品在冰浴条件下进行各步骤操作、离心在4 °C进行。结果显示，低温处理有效抑制了样品制备过程中的细菌生长，接种量与回收量之间无显著差异（p < 0.05），验证了温度控制对保证计数准确性的关键作用。该组样品未进行测序，因研究人员认为基因组测序结果不受处理温度影响。

**大规模实验** 为验证方法的实用性，研究人员将样品量扩大10倍（10 g绞碎牛肉），接种浓度降至10⁰和10¹ cfu g^?1。培养基对照和肉对照均未检出E. coli。平板计数显示接种量与回收量无显著差异（p < 0.05），证明低温处理策略在大样本量条件下依然有效。每个菌落平均产生0.74 Gb测序数据，所有毒力基因平均被检出206次，进一步证实单菌落测序能提供充足的靶基因覆盖度。该实验实现了低至1 cfu g^?1的检测灵敏度，满足FSIS对STEC"零容忍"的检测要求。

讨论部分，研究人员首先阐述了方法设计的核心优势。通过从选择性琼脂平板上的单菌落提取DNA，有效消除了宿主牛DNA对测序的干扰：过滤步骤去除了较大的真核细胞，离心富集了原核细胞，而选择性培养进一步确保了目标菌的纯度。单个典型菌落即可产生平均33 ng μL^?1的DNA，获得约201,995条测序reads，颠覆了"单菌落DNA不足"的疑虑。该方法最显著的突破在于同时解决了三大技术瓶颈：一是通过培养步骤去除了死菌DNA干扰，仅活菌能形成菌落，避免了因检出死菌导致的假阳性和不必要召回；二是取消了传统方法必需的增菌步骤，实现了原始样品中病原体的绝对定量，检测限达1 cfu g^?1；三是单菌落测序策略显著降低了宿主DNA的竞争性抑制。

研究人员也客观分析了方法的局限性。仅选择单个形态典型菌落可能遗漏同一样品中存在的其他血清型，尽管文献报道多种血清型共同污染的发生率较低（如veal基线研究中12%的样本检出多种非STEC血清型，E. coli暴发中仅1%归因于O157与非O157血清型共同污染）。此外，低温实验组未进行测序（因预算限制）、研究仅针对绞碎牛肉中的E. coli O157:H7、未涉及活/死菌混合验证、以及纳米孔技术快速迭代带来的方法再验证需求，均是未来需要完善的方向 nozzle 方向。

研究结论部分的核心内容为：本研究建立了一种将连续稀释涂布培养与长读长测序整合的食品病原菌检测方法。该方法有效解决了既往技术中的关键挑战：通过单菌落分离测序消除了宿主DNA干扰；实现了低浓度活菌（1 cfu g^?1）的精确定量，无需阻碍真正计数的增菌步骤；提供了活菌与非活菌细胞的明确区分，从而减少假阳性。多个菌落也可在一次测序运行中检测，整个流程耗时三天。该方法有望成为改进食品安全风险评估、指导食品行业更有针对性干预策略的有力工具。