多生物信息学方法揭示五味子(Schisandrae Fructus)水提物与乙醇提取物通过COX5B介导调控SW1783细胞中氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)及活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平

《Antioxidants》：Multi-Bioinformatics Approach Reveals COX5B-Mediated Modulation of Oxidative Phosphorylation and ROS Levels by Water and Ethanol Extracts of Schisandrae Fructus in SW1783 Cells

　　

摘要：五味子(Schisandrae Fructus)为传统中药材，常用于抑制亢进状态，具有广泛的治疗作用且副作用少；然而，五味子中多成分共同作用的具体分子机制尚缺乏充分研究。本研究旨在确认五味子热提水提物(Water Extract of Schisandrae Fructus, WESF)与70%乙醇提取物(Ethanol Extract of Schisandrae Fructus, EESF)对氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)的抑制作用，并明确各提取物所影响的相关活性及信号通路。为提高靶点预测准确性，研究人员基于药物–靶标相互作用(Drug–Target Interaction, DTI)、蛋白–蛋白相互作用(Protein–Protein Interaction, PPI)及整合网络进行了中心性分析。分析结果显示，水提物可抑制OXPHOS，且预测细胞色素c氧化酶亚基5B(Cytochrome c Oxidase Subunit 5B, COX5B)为共同作用靶点；中心性分析显示COX5B评分较高，提示其在OXPHOS调控中起高效介导作用。体外实验证实，水提物可下调COX5B表达，并抑制OXPHOS活性及活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)水平。五味子水提物与乙醇提取物对OXPHOS活性的影响存在差异，其中水提物调控的关键靶点为COX5B，可作为潜在的药效生物标志物。上述结果表明，COX5B介导的OXPHOS调节可能是五味子发挥抗癌及抗衰老作用的关键机制。

论文解读：

本研究发表于《Antioxidants》期刊。目前关于传统中药五味子(Schisandrae Fructus, SF)抗氧化、神经保护、抗衰老等作用已有报道，但其富含多类化学成分，具体通过何种分子机制调控线粒体氧化磷酸化(Oxidative Phosphorylation, OXPHOS)及相关活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)生成尚不清楚。传统多用水煎煮(WESF)，现代药理常选用乙醇提取(EESF, 70%乙醇)以获取更多脂溶性木脂素类成分，但两种提取物在分子靶点与通路层面的系统性比较研究较欠缺。由于中药复方/提取物具多成分、多靶点特征，常规单一实验手段难以全面解析其机制，故研究人员采用多生物信息学联合体外实验的策略，探究WESF与EESF对人星形细胞瘤SW1783细胞OXPHOS影响的差异及关键靶点，验证COX5B介导的调控作用及ROS水平变化。

关键技术方法概述：

研究人员制备五味子热回流水提物(WESF)与70%乙醇超声浸提物(EESF)，以人星形细胞瘤SW1783细胞系为研究对象。采用RNA测序(RNA-Seq)获取不同浓度处理组转录组数据，进行差异表达基因(Differentially Expressed Genes, DEGs)分析及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA, MSigDB KEGG库)。从公共数据库收集五味子化合物，按XLogP四分位数分为强亲水(Sphi)、弱亲水(Wphi)、弱疏水(Wpho)、强疏水(Spho)四组。对133个OXPHOS相关蛋白进行大规模分子对接(Autodock Vina, AlphaFold结构)，构建OXPHOS蛋白–蛋白相互作用(PPI)网络(STRING, Louvain聚类)及基于对接的药物–靶标相互作用(DTI)网络。采用BATMAN-TCM平台进行计算多药理学(Polypharmacology, PP)分析并构建PP-DTI网络(PP DTI Network, PDN)。整合对接与PP网络构建首重构网络(First Reconstructed Network, FRN)与次重构网络(Second Reconstructed Network, SRN)，计算度中心性、接近中心性、介数中心性、PageRank及和谐中心性验证COX5B网络枢纽地位。体外通过qPCR验证候选基因表达，寡霉素(Oligomycin)阻断法检测细胞内ATP区分OXPHOS与糖酵解供能比，CellROX荧光探针检测H₂O₂刺激下胞内ROS水平。

研究结果：

3.1. Transcriptome Analysis of WESF and EESF

研究人员对WESF与EESF处理组进行DEG分析与GSEA，发现高剂量WESF引起更多DEGs；KEGG通路中OXPHOS在WESF中呈显著负富集（抑制趋势），在EESF中呈正富集或较弱抑制，二者呈相反调控模式。提取OXPHOS基因集中表达反向的基因，筛选出14个差异基因，为后续靶点筛选提供依据。

3.2. SF Compounds

从TCMSP、BATMAN-TCM、TM-MC收集441个具3D结构的五味子化合物，按XLogP四分位数分组：强疏水(XLogP > 4.9)104个、弱疏水(>4)108个、弱亲水(>2.3)118个、强亲水(≤2.3)111个。

3.3. Large-Scale Molecular Docking Based on OXPHOS-Related Proteins

对441个化合物与133个OXPHOS蛋白做刚性对接，强亲水组(Sphi)平均结合能最低（结合潜力最高）、方差与偏度绝对值最大，提示强亲水性成分配体具多样且高潜力的蛋白互作特征。

3.4. OXPHOS PPI Network

基于STRING构建含132节点、2928边的OXPHOS PPI网络，Louvain算法聚为4群：群1为呼吸链复合体Ⅰ(Complex I)，群2为复合体Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ(Complex II/III/IV)，群3为复合体Ⅴ(ATP合酶, Complex V)，群4为V-ATPase复合体。过代表分析(Over-Representation Analysis, ORA)验证各群功能。结合对接主相互作用结果映射显示，强亲水化合物倾向作用于群2中多个蛋白（标记绿色），其中COX5B表达下调方向与WESF转录组一致。

3.5. qPCR Validation for Candidate Prioritization

对预测的强亲水作用蛋白做qPCR验证，NDUFS5与NDUFS7在各浓度及两种溶剂下均下调，无溶剂差异性；而COX5B在高浓度WESF下显著下调，EESF组无此现象，呈溶剂依赖性差异，故选定COX5B及群2为关键模块进一步分析。

3.6. Docking-Based DTI Network

分别构建四亲水性组的DTI网络，Sphi组化合物数最少(39)但互作蛋白数最多(131)，群2在Sphi中含37个互作蛋白。Sphi组中COX5B与17个化合物节点相连，显示高互作频次。

3.7. Centrality Analysis of Valid Protein Groups Derived from Docking

计算群2蛋白在各DTI网络中连接度(Degree)，COX5B在Sphi中连接度突出；Sphi网络中群2蛋白占总边数的25.5%（四组最高），邻接连通性(Neighborhood Connectivity, NC)密度分布显示Sphi组群2蛋白倾向于连接重要节点。

3.8. Network Construction Using PP

BATMAN-TCM预测得到441个SF化合物与19036个人源蛋白互作，按亲水性分组筛选。ORA显示仅亲水组(Sphi、Wphi)显著富集OXPHOS通路(p adj < 0.05)，疏水组不显著。共得17个影响OXPHOS的蛋白，Sphi组同时涉及琥珀酸脱氢酶(Succinate Dehydrogenase, SDH)与细胞色素c氧化酶(Cytochrome c Oxidase, COX)家族。PP-DTI网络中17个OXPHOS蛋白在Sphi网络中趋中心分布，平均NC达87.8（高于其他组）。

3.9. Docking–PP Integrated Network

整合对接DTI与PP-DTI构建FRN与SRN，Sphi组FRN节点最少(83)但边数最多(451)，COX5B位于Sphi网络几何中心；五种中心性指标（度、介数、接近、PageRank、和谐）经最大–最小归一化后COX5B在Sphi中均最高，其余组居中或较低。箱线图显示COX5B中心性在Sphi中超出上四分位，具Hub属性。SRN中Sphi组COX5B接近中心性(Closeness Centrality)超0.8，进一步确认其为强亲水成分作用的核心节点。

3.10. Effect of WESF and EESF on OXPHOS and Antioxidant Activities

用寡霉素(Oligomycin, 2 mM)抑制ATP合酶后测总ATP与糖酵解供能比，WESF高剂量组OXPHOS被完全抑制，ATP全由糖酵解供给；EESF高剂量组仍保留约14% OXPHOS来源ATP。H₂O₂（0.25 mM）刺激使胞内ROS升高约230%，WESF高浓度显著抑制该升高，EESF无此效应；无H₂O₂刺激时WESF轻微降基础ROS，EESF无影响。

讨论与结论：

研究人员通过自上而下逐层筛选（转录组→PPI/对接→qPCR→多网络整合中心性分析→体外验证）锁定COX5B为五味子水提物抑制OXPHOS的关键介质。多生物信息学方法交叉验证提高结果稳健性。WESF而非EESF可剂量依赖性抑制SW1783细胞OXPHOS活性、下调COX5B表达并降低H₂O₂诱导的ROS水平，提示WESF通过COX5B介导的OXPHOS抑制减少电子漏减少ROS生成，可能与既往报道的五味子神经保护、抗癌及抗衰老效应相关。研究局限在于未进行WESF/EESF的LC-MS/MS化学组分定性定量比对，化合物亲水性分组基于计算XLogP四分位近似模拟水/醇提取差异。结论如下：五味子热提水提物(WESF)可通过强亲水性成分靶向细胞色素c氧化酶亚基5B(COX5B)，抑制线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)活性并降低活性氧(ROS)水平；COX5B是WESF调控OXPHOS的关键靶点及潜在药效生物标志物；COX5B介导的OXPHOS调节可能是五味子发挥抗癌与抗衰老作用的重要分子机制；水提物与70%乙醇提取物对OXPHOS具差异性调控，为传统水煎煮用药提供分子层面依据。