不同发酵剂酸奶在体外胃肠系统中的微生物动态变化——基于16S rRNA测序分析

《Foods》：Microbial Dynamics of Yogurts with Different Starter Cultures Under an In Vitro Gastrointestinal System Using 16S rRNA Sequencing

　　

背景：本研究旨在比较使用不同发酵策略生产的酸奶在动态体外胃肠系统消化应激下的微生物多样性和组成变化。方法：研究人员采用动态体外胃肠系统（包括口腔、胃和小肠阶段，在受控pH、温度和消化条件下），评估了使用益生菌发酵剂、标准酸奶发酵剂以及益生菌补充包生产的酸奶。通过基于16S rRNA扩增子的Oxford Nanopore测序方法测定体外胃肠模拟前后的微生物多样性和组成变化，并利用生物信息学、α多样性和β多样性指标对所得数据进行分析。结果：与发酵剂酸奶相比，添加益生菌补充包显著增加了微生物物种丰富度、α多样性和群落平衡（Shannon和Inverse Simpson指数，p < 0.05）。体外胃肠系统导致所有样品中厚壁菌门（Firmicutes）主导的核心微生物群减少；相反，β多样性和主坐标分析（PCoA）显示，补充包酸奶消化后的微生物结构与发酵剂酸奶存在显著差异（PERMANOVA，p = 0.001）。结论：因此，研究表明在酸奶中添加益生菌补充包可增加整个消化道中有益菌的多样性和耐受性，使产品成为一种更具健康益处的强健功能食品。

**研究背景与目的**
酸奶是一种发酵乳制品，传统上使用保加利亚乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）作为发酵剂。益生菌被定义为“当摄入足够数量时对宿主胃肠道系统产生健康益处的活微生物”，需具备耐胃酸、耐胆汁盐并在肠道定殖的能力（≥10⁶–10⁸ CFU/g或mL）。近年来，通过改变食品基质和结构特性来优化消化吸收行为的研究日益增多。体内人体研究虽为金标准，但存在技术、经济和伦理限制，且重复性低。因此，研究人员开发了模拟口腔、胃和小肠阶段的体外胃肠模型，以提供更灵活、准确和可重复的替代方案。16S rRNA扩增子测序可直接从样品中提取DNA鉴定微生物类群、群落多样性和种群结构。
**当前问题与本研究目的**：尽管已有技术进展，但将动态胃肠系统模型与16S rRNA微生物谱分析相结合来评估不同益生菌发酵策略下酸奶微生物存活的研究仍然有限。本研究旨在探究使用益生菌发酵剂、标准酸奶发酵剂和益生菌补充包生产的酸奶在动态体外胃肠条件下微生物动态和组成变化，假设益生菌补充包能增强微生物多样性并改善模拟消化过程中的微生物存活性。

**主要技术方法**
研究人员采用动态体外胃肠模型（模拟口腔5 min、胃2 h、小肠2 h，持续监测pH和温度），利用人工唾液（含α-淀粉酶、黏蛋白）、胃液（含胃蛋白酶、黏蛋白，pH逐步降至2.5）和小肠液（含胰酶、胆汁盐，pH逐步升至6.9）。DNA提取使用物理破碎法（ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit），采用Oxford Nanopore Technologies (ONT) MinION Mk1B平台进行全长16S rRNA测序，经Dorado碱基识别、bbduk修剪、medaka纠错及blastn注释，数据库包括NCBI RefSeq等。统计分析采用R语言，包括α多样性（Observed、Shannon、Inverse Simpson指数）和β多样性（Jaccard、Bray–Curtis，PCoA可视化，PERMANOVA检验）。样本来源为市售益生菌发酵剂和益生菌补充包，按字母编码（A–M），分为益生菌发酵剂酸奶组（PS，代码A–F）和标准发酵剂加补充包组（SA，代码H–M）。

**研究结果**
**3.1 物种组成**：PS组酸奶（A–F）优势菌为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌，构成酸奶特征性微生物群；部分样品检测到低丰度的婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）和长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）。SA组酸奶（H–M）呈现更异质的组成，包括乳酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）、乳双歧杆菌（Bifidobacterium animalis subsp. lactis）和屎肠球菌（Enterococcus faecium），丰度各异。
**3.2 α多样性**：在属水平上，PS组Observed属数47–129，SA组80–240；ACE指数在SA组显著升高（p = 0.05），Shannon指数（p = 0.04）和Inverse Simpson指数（p = 0.03）亦显著高于PS组，说明SA组物种丰富度更高且群落分布更均衡。PS组Shannon值范围3.40–5.44，SA组1.21–5.59，呈现更大异质性。CN组（初始酸奶）Observed属数53–224，GO组（口腔阶段）49–126，G2组（小肠结束）更异质（40–250）；仅ACE指数组间差异显著（p = 0.01）。
**3.3 门水平组成**：所有样品中厚壁菌门（Firmicutes/Bacillota）占主导（95–100%）。PS组门水平分布均一，仅少数样品含少量放线菌门（Actinomycetota）和拟杆菌门（Bacteroidota）。SA组则检测到更高比例的放线菌门（与双歧杆菌有关）和拟杆菌门。对比GO与G2样品，GO阶段呈现多门异质性（含放线菌门、拟杆菌门、变形菌门），而G2阶段几乎全部浓缩为厚壁菌门（95–100%），放线菌门仅G2H和G2L中低水平保留，拟杆菌门与变形菌门基本消失。这表明消化过程对双歧杆菌等敏感类群产生强烈筛选压力。
**3.4 α多样性小提琴图**：CN组Observed指数范围最宽（~50–220），GO组收缩至~40–100，G2组重新异质化（~40–250）；Shannon指数CN组高于GO组，G2组变异极大；Inverse Simpson指数CN组分布窄且较高（低优势种），GO组低而集中（高优势种），G2组最宽（~0.5–7）。PS组与SA组对比：SA组Observed丰富度、Shannon和Inverse Simpson指数均显著高于PS组（p < 0.05），表明SA组微生物群落更丰富、更均衡。
**3.5 β多样性（PCoA）**：基于Bray–Curtis距离的PCoA显示，CN、GO、G2三组显著分离（PERMANOVA p = 0.001，前两轴解释76.5%方差）。CN样品紧密聚类，GO样品分散，G2样品形成独立但相对分散的第三簇。PS与SA组PCoA分析显示两组完全分离（前两轴解释93.4%方差，PERMANOVA p = 0.001），PS组紧密聚类，SA组广泛分散，表明两种生产策略形成生物学上截然不同的微生物生态。

**讨论与结论**
**讨论**：本研究揭示了生产方式和消化条件均显著改变酸奶微生物群。PS组呈现高度均一、低变异、可预测的微生物轮廓，与工业发酵标准化的控制一致。SA组添加益生菌补充包后α多样性显著升高，门水平出现放线菌门等异质性成分。胃肠道模拟导致G2阶段厚壁菌门高度优势，双歧杆菌显著减少，这与鼠李糖乳杆菌和保加利亚乳杆菌的酸耐受和胆盐耐受机制（如F₀F₁-ATP酶质子泵、胆汁盐水解酶活性、应激蛋白和膜修饰）一致，而双歧杆菌对氧气和酸性环境敏感。PCoA中PS与SA组的完全分离（PERMANOVA p = 0.001）表明两种产品在物种丰富度、优势种和分类组成上形成完全不同的生态系统。G2样品的独立聚类说明消化后微生物群达到新的生态平衡。
**研究结论**：本研究表明，酸奶生产中的两种不同益生菌策略对体外胃肠微生物群落结构产生多方面深远影响。发酵剂酸奶具有高度均一性和可预测的微生物结构，技术稳定性更强。添加益生菌补充包的酸奶提供更高的物种丰富度和多样性，但微生物谱变异更大。体外胃肠系统在很大程度上消除了发酵剂产品间的差异，创造出仅由耐受性物种主导的新核心微生物群。从消费者角度，真正的益生菌益处更多取决于消化后存活的物种而非产品初始组成。这些发现为益生菌产品开发、酸奶技术、临床营养和微生物群研究提供了重要参考，表明益生菌的物种选择、剂量和配方策略应充分考虑消化后生态系统行为。