超声(Ultrasound)辅助深共晶溶剂(Deep Eutectic Solvent, DES)三相分配(Three-Phase Partitioning, TPP)体系用于龙眼壳(Longan Shell)多糖提取：工艺优化、理化性质、结构表征与抗氧化活性

《Foods》：Ultrasound-Assisted Deep Eutectic Solvent Three-Phase Partitioning System for Extraction of Polysaccharides from Longan Shell: Process Optimization, Physicochemical Properties, Structural Characterization, and Antioxidant Activities

　　

在本研究中，研究人员提出了一种结合超声增强提取与使用疏水性深共晶溶剂(DES)及三相分配(TPP)的方法，用于绿色分离龙眼壳多糖(LSP)。提取体系采用由十二酸(dodecanoic acid)与辛酸(octanoic acid)等摩尔比组成的DES作为分离介质。研究人员系统考察了多糖纯化涉及的主要相分离机制，并通过单因素实验结合响应面法(RSM)系统优化得到理想操作参数：提取温度63.8 °C、相比（上相/下相）1:1.04（v/v）、硫酸铵浓度26.3%。在上述参数下LSP提取率为2.42 ± 0.03%。结构表征表明，分离得到的LSP是一种富含半乳糖醛酸(galacturonic acid)和阿拉伯糖(arabinose)的酸性杂多糖(acidic heteropolysaccharide)；LSP的分子架构同时包含α型和β型糖苷键(glycosidic bonds)，这对理化性质具有重要意义；多糖呈现开敞纤维网状结构。值得注意的是，DES在连续五次重复使用时保持性能稳定，无显著降解。在抗氧化能力方面，0.4 mg/mL的LSP对ABTS自由基抑制率达96.6 ± 2.0%，铁还原能力为68.67 ± 2.02 μmol Trolox每克（浓度依赖效应）。这些结果提出了一种可持续提取生物活性大分子的新方法。

研究背景方面，龙眼(Dimocarpus longan Lour.)为无患子科(Sapindaceae)常绿果树，广泛分布于热带与亚热带地区，其可食果肉被广泛利用，而龙眼壳(Longan Shell)多被废弃或用作低级燃料，造成资源浪费与环境负担。已有研究表明龙眼壳含多糖、多酚等生物活性成分，具有抗氧化、抗菌、降血糖等潜在活性。传统热水提取(HWE)虽简单安全，但存在时间长、提取率低、选择性差、热损伤风险等问题；微波辅助易产生局部过热导致多糖热降解；酶辅助成本较高且需严格pH控制。三相分配(TPP)是一种简单、低成本、绿色的纯化技术，常规TPP使用叔丁醇(t-butanol)作为有机相，但叔丁醇具有高挥发性、易燃、有毒、有爆炸风险等安全隐患，限制了其在食品与医药领域的应用。深共晶溶剂(DES)是由氢键受体(HBA)与氢键供体(HBD)通过氢键作用形成的低共熔混合物，具有低蒸气压、可调物化性质、低毒、可循环、强溶解能力等绿色溶剂特征。超声辅助提取(Ultrasound-Assisted Extraction, UAE)通过声空化(cavitation)产生微射流与局部高压破坏细胞壁，在温和体相温度下强化传质，优于微波与酶法。目前DES已用于多糖提取，TPP使用叔丁醇也已用于多糖纯化，但将疏水性DES引入TPP体系并与超声协同用于龙眼壳多糖一步提取纯化尚未见报道。该研究旨在建立超声辅助深共晶溶剂三相分配(UA-DES-TPP)新方法，以DES替代有毒叔丁醇，实现龙眼壳多糖高效、绿色、可循环的一步提取纯化，并与传统热水提取(HWE)产品在结构、理化性质及抗氧化活性上系统比较，论文发表于《Foods》。

研究人员开展的主要关键技术方法包括：样本为广西产龙眼壳，经脱脂（石油醚）、脱色素（80%乙醇）预处理后备用；筛选由不同脂肪酸组成的DES（DES-1：十二酸与辛酸1:1摩尔比；DES-2、DES-3为其他脂肪酸组合）作为TPP上相替代叔丁醇，以硫酸铵水溶液为下相构建三相体系；采用单因素实验考察超声时间、液固比、硫酸铵浓度、上/下相比、提取温度对LSP得率的影响；基于单因素结果选取提取温度、硫酸铵浓度、上/下相比三个显著因素，以Box–Behnken设计(BBD)进行响应面法(RSM)优化并得到最优参数；以传统叔丁醇TPP为阳性对照，传统热水提取(HWE)为对照比较；DES循环使用性能通过连续五次提取实验评估；多糖得率采用苯酚–硫酸法(phenol–sulfuric acid method)以葡萄糖标曲测定，蛋白含量采用考马斯亮蓝(Bradford)法以牛血清白蛋白(BSA)为标品测定；紫外–可见(UV-Vis)光谱扫描200–600 nm评估核酸与蛋白残留；结构表征手段包括扫描电镜(SEM)观察微观形貌，凝胶渗透色谱(GPC)测定相对分子量分布，傅里叶变换红外光谱(FT-IR)分析官能团与糖苷键构型，PMP(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)衍生化结合高效液相色谱(HPLC)分析单糖组成；理化性质测定包括pH、溶解度（25、60、80 °C）、CIE L^*a^*b^*色度、Zeta电位（pH 3–11，10 mmol/L NaCl固定离子强度）；热稳定性采用热重分析(TGA)与微分热重(DTG)；抗氧化活性采用ABTS自由基清除实验与FRAP铁还原抗氧化能力实验，以Trolox为标准品。

1. 3.
   Results（结果）：3.1. Screening and Selection of DES for LSP Extraction（DES筛选与选择）：研究人员比较三种DES与叔丁醇TPP的LSP得率，DES-TPP得率（1.45%–1.57%）显著高于叔丁醇TPP（1.10%），其中DES-1（十二酸:辛酸=1:1摩尔比）得率最高（1.57%），因其C8/C12链长平衡了亲/疏水性与粘度，利于传质与相分离，故选DES-1用于后续实验。3.2. Single-Factor Experimental Analysis（单因素实验分析）：超声时间在25–35 min内得率最高（约1.52%），超过35 min因过长超声剪切导致降解而下降，确定25 min较优；液固比在1:20–1:25得率较高（1.53%左右），1:20与1:25无显著差异(p>0.05)，兼顾溶剂成本选1:20；硫酸铵浓度在25%时得率最高（1.78±0.03%），低于或高于25%均下降，因盐析效应与离子强度影响相分离与多糖分配；上/下相比1:1时得率最高（1.59±0.02%），偏大如1.5:1扰动传质使得率降至1.35%；提取温度65 °C时得率峰值（1.87±0.03%），过高（>65 °C）会破坏DES氢键网络致三相失稳，得率下降。3.3. Process Optimization for TPP Extraction（TPP工艺优化）：基于单因素选取温度(A:55–75 °C)、硫酸铵浓度(B:20–30%)、上/下相比(C:0.5:1–1.5:1)进行Box–Behnken设计，拟合二次模型Y=2.41?0.0365A+0.1219B?0.0431C?0.0558AB+0.1622AC+0.0360BC?0.2579A²?0.2347B²?0.3466C²（Y为LSP得率%）。模型极显著(p<0.001)，失拟不显著(p=0.3046>0.05)，R²=0.9923，调整R²=0.9826，CV%=1.94，预测可靠；因素重要性为B（硫酸铵浓度）>C（相比）>A（温度），交互项AC显著；优化得：温度63.8 °C、上/下相比1:1.04（v/v）、硫酸铵26.3 wt%，预测得率2.44%；验证实验实际得率2.42±0.03%，与预测无显著差异(t检验p=0.118)。3.4. Polysaccharide Yield and Purity Analysis（多糖得率与纯度分析）：优化条件下LSP得率2.42%，多糖含量89.03%，蛋白含量1.83%；与文献热水提取（约1.06%）比提高128.30%，与超声辅助提取（约0.55%）比提高约340%；UV-Vis光谱在200 nm有多糖典型末端吸收，260 nm与280 nm无明显吸收，表明核酸与蛋白残留低，印证纯度较高。3.5. Recycling and Reusing of DESs（DES循环使用）：DES上相连续使用五次，首次得率2.42%，第五次仍达约1.92%（降幅约0.5个百分点，保留约80%原始得率），显示良好可再生性。3.6. Structural Characterization（结构表征）：3.6.1. Scanning Electron Microscope Analysis（扫描电镜分析）：LSP-TPP（UA-DES-TPP产物）呈均匀三维交织超细纤维网状结构，孔径小而均匀，无大团聚与可见杂质；LSP-HWE（热水提取产物）呈不规则片状团聚、粗纤维、孔隙不均、松散粗糙；表明DES-TPP温和条件更好保持天然网络结构，减少聚集与杂质共提。3.6.2. Relative Molecular Weight Analysis（相对分子量分析）：GPC显示LSP重均分子量(Mw)约375.566 kDa，主要在>100 kDa大分子区间，少量<10 kDa片段（洗脱时间10.30 min），表明工艺能有效维持多糖链完整性，少链断裂降解。3.6.3. Fourier Transform Infrared Spectroscopic Examination（傅里叶变换红外光谱分析）：3401 cm^?1宽峰为O-H伸缩（氢键），2934 cm^?1弱峰为C-H伸缩，1743 cm^?1（酯化羧基C=O）与1617 cm^?1（游离羧基不对称伸缩）及1417 cm^?1（非酯化羧基对称伸缩）证实果胶样多糖特征；1144、1100、1075、1049 cm^?1为C-O-C与C-O伸缩（呋喃/吡喃糖），1049 cm^?1主峰源于呋喃环C-O，1100与1075 cm^?1对应吡喃糖（半乳糖、葡萄糖）；830 cm^?1提示α-糖苷键，889 cm^?1弱峰提示β-糖苷键（半乳糖、木糖侧链），表明LSP为含α/β-糖苷键的酸性杂多糖。3.6.4. Monosaccharide Composition Analysis（单糖组成分析）：PMP-HPLC显示LSP主要由半乳糖醛酸(galacturonic acid, 29.550 mg/g)、阿拉伯糖(arabinose, 11.137 mg/g)、半乳糖(galactose, 10.191 mg/g)组成，另含鼠李糖(rhamnose)、葡萄糖(glucose)、葡糖醛酸(glucuronic acid)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、岩藻糖(fucose)、核糖(ribose)等；摩尔比约为GalA:Ara:Gal:Rha:Glc:GlcA:Xyl:Man:Fuc:Rib=37.86:18.45:14.07:10.08:8.60:3.47:2.93:2.67:1.51:0.35，证实为富含半乳糖醛酸的酸性杂多糖。3.7. Physicochemical Properties of LSP（LSP理化性质）：3.7.1. pH：LSP-TPP pH为4.18±0.02，LSP-HWE为5.07±0.03，均为酸性杂多糖，DES-TPP产物pH更低因其选择性富集酸性组分（如半乳糖醛酸）。3.7.2. Solubility（溶解度）：两样品溶解度均随温度升高而增加（热运动削弱分子间氢键，暴露更多亲水基团）；同温下LSP-TPP溶解度高于LSP-HWE，如80 °C时LSP-TPP约98.5%，LSP-HWE约95.1%，因DES与亲水基团形成氢键网络增强亲水性。3.7.3. Color Profile（颜色特征）：LSP-TPP溶液与超纯水的总色差ΔE仅0.69，澄清透明；LSP-HWE的ΔE达2.08，显暗红褐色；说明DES-TPP温和条件减少美拉德褐变与色素共提，产品色浅纯度高。3.7.4. Zeta Potential（Zeta电位）：两样品在pH 3.0–11.0均带负电（酸性多糖特征）；LSP-TPP在pH 5–11的|ZP|>30 mV（高胶体稳定性），pH=3时|ZP|<20 mV（稳定性降）；LSP-TPP各pH下|ZP|均大于LSP-HWE，因其含更高半乳糖醛酸等酸性基团，胶体稳定性更优。3.8. Functional Properties（功能性质）：3.8.1. Thermal Analysis（热分析）：TG-DTG显示LSP-TPP与LSP-HWE均为典型三段热解模式，趋势相近；600 °C残碳率LSP-TPP（25.64%）高于LSP-HWE（24.22%）；低温峰（~72–74 °C）对应结合水与小分子挥发，LSP-TPP失重略低（13.00% vs 13.41%）暗示结合水略少；高温峰（~258–260 °C）对应主链糖苷键断裂，LSP-TPP峰稍宽说明多组分协同降解；DES-TPP选择性富集半乳糖醛酸（形成分子内氢键）增强碳化能力，热稳定性较好。3.8.2. Antioxidant Potential（抗氧化潜力）：ABTS实验显示LSP-TPP清除率具浓度依赖性，0.4 mg/mL时达96.6±2.0%，EC₅₀约0.13 mg/mL（低于文献热水提取的0.21 mg/mL）；FRAP实验0.4 mg/mL时达68.67±2.02 μmol Trolox每克；抗氧化增强可能与高半乳糖醛酸含量（羧基供电子/螯合金属）、开敞纤维网络结构（提升反应性基团可及性）、更高溶解度有关；LSP-TPP分子量375.6 kDa在10–1000 kDa公认高活性区间内；数据表明DES-TPP提取未损害抗氧化活性，反而优于或与常规提取相当。

讨论部分指出，本研究主要局限在于DES-TPP与叔丁醇TPP仅比较了得率，未全面比较结构与抗氧化；未做抗菌实验；均为体外实验，缺乏体内抗氧化与生物利用度数据；未来需开展：抗菌实验（测定MIC等）、动物模型氧化应激 biomarker与组织病理研究、构效关系（分子量、糖苷键、分支度与活性关联）、体内代谢与机制研究；此外叔丁醇TPP对照仅为得率参照，全面等效表征是后续方向。结论部分翻译如下：本研究建立了超声与DES介导三相分配结合的集成可持续策略，用于龙眼壳生物质多糖分离；由十二酸与辛酸（1:1摩尔比）组成的疏水性低共熔混合物作为相分离剂，是常规叔丁醇更安全绿色的替代；通过单因素结合响应面法确定最优参数：液固比1:20 g/mL、上/下相比1:1.04 v/v、硫酸铵浓度26.3 wt%、超声时间25 min、提取温度63.8 °C；优化下多糖得率2.42±0.03%；DES显示优异可再生性，五次循环后得率从2.42%降至约1.92%（降幅约0.5个百分点，保留约80%原得率）；LSP主要单糖为半乳糖醛酸与阿拉伯糖；UA-DES-TPP产物(LSP-TPP)理化性质优于LSP-HWE；功能评估证实LSP具良好热稳定性与突出抗氧化活性，0.4 mg/mL时ABTS清除率96.6±2.0%，FRAP能力68.67±2.02 μmol Trolox/g；未来需体内抗氧化与构效研究；该工艺显著提升LSP提取效率与产品质量，为LSP大规模绿色生产及功能性食品开发提供可持续路径；UA-DES-TPP使用可循环DES与温和条件，也可能带来经济效益，并可拓展至其他农副产物生物活性多糖提取。