建立新型替代方法（New Approach Methodologies, NAMs）框架评估纳米塑料的生物响应：来自聚苯乙烯与生物可降解颗粒的启示

《Nanomaterials》：Developing a New Approach Methodology Framework to Assess Biological Responses to Nanoplastics: Insights from Polystyrene and Biodegradable Particles

　　

摘要：环境中广泛存在的微纳塑料（Micro- and Nanoplastics, MNPs）对人类及环境健康构成新发风险。新型替代方法（New Approach Methodologies, NAMs）为阐明纳米尺度过程的作用机制及在无动物实验条件下进行危害识别提供了有力工具。研究人员采用先进体外肠道模型及符合3R原则的体内模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），考察了0–100 μg/mL浓度下100 nm和20 nm聚苯乙烯纳米塑料（Polystyrene Nanoplastics, PS-NPs）及100 nm聚己内酯纳米塑料（Polycaprolactone Nanoplastics, PCL-NPs）暴露后的生物学效应。体外终点包括细胞毒性、氧化应激、DNA损伤、细胞摄取及屏障完整性；体内分析聚焦于多代暴露下的氧化应激反应与运动行为。PS-NPs在体外诱导显著DNA损伤（尤其≥50 μg/mL，暴露24–48 h），并被细胞快速内化，其中20 nm颗粒可进入细胞核；相比之下100 nm PCL-NPs引发的生物学响应较弱。体内实验中，PS-NPs引起跨代氧化应激反应增强及运动行为改变，而PCL-NPs效应轻微，与体外结果一致。上述结果支持整合NAMs在"同一健康（One Health）"框架下评估MNPs相关人体健康风险的潜力。

论文解读：建立新型替代方法（NAMs）框架评估纳米塑料的生物响应——来自聚苯乙烯与生物可降解颗粒的启示

一、研究背景与立题依据

微纳塑料（Micro- and Nanoplastics, MNPs）因广泛存在于食物、饮用水及环境中，经口摄入成为人体主要暴露途径，胃肠道是其首要交互部位。MNPs可能损害肠上皮屏障完整性，并通过氧化应激、炎症及基因毒性等机制产生不良效应。然而目前MNPs的危害识别仍呈碎片化且缺乏标准化，难以支撑监管风险评估。传统毒理学方法耗时、涉及伦理问题且与人体相关性有限。经合组织（OECD）、欧洲食品安全局（EFSA）及欧洲化学品管理局（ECHA）日益倡导使用新型替代方法（New Approach Methodologies, NAMs）——包括体外模型、无脊椎动物体内模型、高内涵筛选及组学技术等，遵循动物实验替代、减少与优化（3Rs）原则并提高毒性评估预测力。但NAMs在MNPs评估中受限于缺乏统一测试策略、标准物质表征及可比数据集。本研究选用常用参照物聚苯乙烯纳米塑料（Polystyrene Nanoplastics, PS-NPs）与代表性生物可降解聚己内酯纳米塑料（Polycaprolactone Nanoplastics, PCL-NPs），通过整合分层NAMs策略（tiered NAM-based approach），在细胞至整体动物水平比较不同粒径与聚合物类型的生物学响应，为MNP危害评估提供机制性数据并验证NAMs框架适用性。本文发表于《Nanomaterials》。

二、主要关键技术方法

研究人员选用商品化单分散球形100 nm PS-NPs（Merck/Sigma-Aldrich）、20 nm PS-NPs（Thermo Fisher Scientific）及100 nm PCL-NPs（Merck/Sigma-Aldrich），按Nanogenotox标准操作程序（SOP）制备悬液并经动态光散射（Dynamic Light Scattering, DLS）测定水及细胞培养基中流体力学尺寸与ζ电位（zeta-potential）。体外采用人结肠腺癌Caco-2单层细胞及具黏液分泌与M细胞特征的Caco-2/HT29-MTX/Raji-B三细胞共培养肠屏障模型，检测细胞毒性[MTS法、台盼蓝（Trypan Blue）排斥试验]、透射电镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）观察细胞内吞与亚细胞定位、氧化应激[胞内还原型与总谷胱甘肽（reduced and total glutathione, rGSHi/tGSHi）及培养基低分子硫醇HPLC检测]、碱性彗星试验（Comet Assay）含甲酰胺基嘧啶-DNA糖基化酶（Formamidopyrimidine-DNA Glycosylase, FPG）修饰检测氧化碱基损伤、荧光黄（Lucifer Yellow, LY）旁细胞通透实验评价屏障完整性。体内采用野生型Bristol N2及转基因CL2166[dvIs19 (pAF15)gst-4p::GFP::NLS，报告skn-1/Nrf2依赖的氧化应激响应]秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans），持续多代（P0–F2）暴露于纳米塑料悬液，定量评估身体弯曲（body bends）与头部摆动（head thrashes）运动能力及GFP荧光强度。统计学采用双因素/单因素方差分析（two-way/one-way ANOVA）及Dunnett's、Bonferroni's事后检验。数据进行初步FAIR（Findable, Accessible, Interoperable, Reusable）原则模板匹配评估。

三、研究结果

3.1. Nanoplastic Particles Characterization（纳米塑料表征）

DLS显示PS-NPs在水及培养基中尺寸符合预期，负ζ电位；入培养基后尺寸略增大、ζ电位绝对值下降，提示蛋白冠（protein corona）形成，100 nm PS-NPs 48 h内轻微聚集。PCL-NPs折射率接近血清蛋白致散射峰重叠，强度加权分布多分散，入培养基后尺寸无明显变化，ζ电位近中性微升，提示形成薄/软蛋白冠且无显著聚集。悬液在实验条件下相对稳定。

3.2. Cytotoxicity in Monocultures of Caco-2 Cells（Caco-2单细胞层细胞毒性）

0–100 μg/mL暴露24 h及48 h，PS-NPs与PCL-NPs均未引起Caco-2细胞存活率显著下降，支持后续亚致死浓度下功能与基因毒性检测之合理性。

3.3. Cell Internalization（细胞摄取与亚细胞定位）

TEM显示两种尺寸PS-NPs均被Caco-2细胞内吞：20 nm PS-NPs 1 h弥散于胞质，4 h至核周区，24 h见小颗粒靠近/进入核内（nuclear-associated localization）；100 nm PS-NPs 1 h滞留于微绒毛或溶酶体样结构内聚团，4 h见于胞质及近核区大簇，24 h见溶酶体降解结构。未见线粒体定位改变或超微结构损伤。PCL-NPs因停产未做TEM。

3.4. In Vitro Oxidative Stress（体外氧化应激）

Caco-2细胞经各NPs 0–100 μg/mL处理24 h及48 h，胞内总谷胱甘肽（total glutathione, tGSHi）、还原型比例（rGSHi/tGSHi）及培养基半胱氨酸、同型半胱氨酸等相关硫醇均无显著处理效应，提示本实验条件下三种NPs未诱发可检测的氧化应激。

3.5. DNA Damage Evaluation by Comet Assay（彗星试验评估DNA损伤）

100 nm与20 nm PS-NPs在≥50 μg/mL（48 h）或全浓度（20 nm，24 h）致%Tail DNA显著升高（p < 0.05），FPG修饰试验仅20 nm PS-NPs 100 μg/mL 48 h检出氧化嘌呤显著增加（p < 0.005），表明主要为非氧化性DNA链断裂，20 nm颗粒因核易位致更低浓度即起效。100 nm PCL-NPs各剂量/时点均为阴性，无碱基氧化损伤。

3.6. Barrier Integrity（屏障完整性）

PS-NPs（尤其100 nm）最高浓度24 h致LY旁细胞通透轻度升高，48 h趋向恢复，提示短暂紧密连接干扰及适应性；PCL-NPs无影响。各组未达统计学显著性但趋势与材料依赖性相符。

3.7. C. elegans Data（秀丽隐杆线虫数据）

3.7.1. Effect of PS-NP (100 nm) Exposure：100 nm PS-NPs致P0代起剂量依赖性运动减弱（最低1 μg/mL体弯显著），F1代表观敏感（最低浓度即显著），F2代部分适应；CL2166株gst-4::GFP荧光强度剂量依赖性升高（最高浓度显著），多代趋势一致。

3.7.2. Effect of PS-NPs (20 nm) Exposure：20 nm PS-NPs运动抑制更强（P0最低浓度即显著），F2代运动及氧化应激响应均显著高于同浓度100 nm PS-NPs（p < 0.0001），证实尺寸越小生物活性越强。

3.7.3. Effect of PCL-NPs (100 nm) Exposure：100 nm PCL-NPs仅最高浓度P0代轻微降运动（体弯p < 0.005，摆头p < 0.05），F1更弱；GFP荧光无显著诱导，与体外温和效应吻合。

3.8. Results of the FAIRification（FAIR化结果）

MTS、彗星试验、屏障通透性模板可直接套用；粒径/ζ电位及氧化应激需调整；线虫行为与氧化应激响应模板缺失需新建，标志项目处于FAIR数据初步整理阶段。

四、讨论与结论总结

讨论指出PS-NPs可被肠上皮细胞高效内化，20 nm颗粒能接近/进入细胞核引发更早且更强的基因毒性及体内多代运动/氧化应激效应，体现尺寸依赖性与聚合物依赖性。PCL-NPs体外无细胞毒、基因毒及屏障破坏，体内仅微弱效应，提示生物可降解聚酯在测试条件下较传统PS风险低，但需更多研究确认。体外Caco-2谷胱甘肽指标未变而线虫gst-4报告阳性，反映体外单层上皮抗氧化缓冲力强，整体动物具组织整合性与SKN-1/Nrf2高敏转录读出优势，也受多代累积暴露、肠道微环境改性与间接ROS介导影响。整合分层NAMs（体外肠屏障+线虫多代）给出跨体系一致趋势，证明此概念验证框架可用于MNP差异化危害筛查。局限含未测递送剂量与内毒素、PCL-NPs缺TEM定量、未测炎症/免疫端点、暴露浓度高于环境现实值等，指明未来需加量化摄取、免疫指标及真实场景模拟。

结论（Concluding Remarks）：

目前MNP尤其是持久性颗粒长期效应的毒理证据尚不充分，缺乏适合监管决策的人体健康风险评估框架。本研究展示的分层NAMs策略结合FAIR导向数据实践，有助于提升未来研究的一致性与可解释性，并为"更安全设计（safer-by-design）"视角下替代材料的评估与优先排序提供依据。