6PPD与6PPD-Q在神经退行性疾病中毒性作用的分子机制：一项网络毒理学与实验验证研究

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《Toxics》：Molecular Mechanisms of 6PPD and 6PPD-Q Toxicity in Neurodegenerative Diseases: A Network Toxicology and Experimental Validation Study

【字体：大中小】 时间：2026年06月10日 来源：Toxics 4.1

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　　摘要：6PPD是一种广泛使用的轮胎抗氧化剂，可轻易转化为毒性更强的臭氧化产物6PPD-quinone（6PPD-Q）。这两种化合物均为新兴环境污染物，具有潜在神经毒性风险，但其对阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的分子机制尚不清楚。本研究整合网络毒理学、分

摘要：6PPD是一种广泛使用的轮胎抗氧化剂，可轻易转化为毒性更强的臭氧化产物6PPD-quinone（6PPD-Q）。这两种化合物均为新兴环境污染物，具有潜在神经毒性风险，但其对阿尔茨海默病(AD)和帕金森病(PD)的分子机制尚不清楚。本研究整合网络毒理学、分子对接、转录组验证及实验模型以探究其神经毒性效应。计算机(in silico)分析预测两种化合物均具有显著神经毒性和血脑屏障(BBB)透过性。靶标预测与蛋白?蛋白互作(PPI)网络分析鉴定出6PPD与AD/PD重叠靶标分别为145/121个，6PPD-Q与AD/PD重叠靶标分别为120/100个。功能富集分析提示6PPD相关靶标主要富集于轴突再生、p75NTR及AGE-RAGE相关通路，而6PPD-Q相关靶标富集于MAPK级联、内体TLR信号及淀粉样?β(Aβ)形成相关通路。分子对接表明这些化合物与若干核心靶标（包括MAP2K1、EGFR、GSK3B及CYCS）具有良好结合亲和力。GEO数据集转录组验证筛选出多个枢纽基因。体内实验显示脑内凋亡相关信号激活，体外实验证明活性氧(ROS)累积及神经炎性激活（TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ升高）。CYCS与MAP2K1成为关键汇聚节点。研究人员的结果揭示了6PPD与6PPD-Q在AD和PD中不同但协同的神经毒性机制，凸显轮胎衍生污染物作为神经退行性疾病潜在环境风险因素的重要性。

论文解读如下。研究背景方面，全球化与城市交通扩张使轮胎生产消费居高不下，轮胎配方中广泛使用的对苯二胺类抗氧化剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺（6PPD）可经轮胎—道路磨损颗粒(TRWP)释放入环境，并在大气臭氧作用下转化为毒性更强的醌衍生物6PPD-quinone（6PPD-Q）。6PPD-Q已被确认为导致银大马哈鱼城市径流死亡综合征的主要毒物和新兴环境污染物，在道路粉尘、颗粒物、雨水径流、地表水及人体血液、尿液、脑脊液(CSF)中均有检出，哺乳动物实验提示其可致多器官毒性。阿尔茨海默病(AD)与帕金森病(PD)是最主要的神经退行性疾病，分别以淀粉样?β(Aβ)沉积、tau病理及黑质纹状体多巴胺能神经元变性、α?突触核蛋白病变为特征，线粒体功能障碍、氧化应激、神经炎症、血脑屏障(BBB)破坏及免疫代谢失衡为共同过程。已有斑马鱼与哺乳动物研究显示6PPD可致脑血管缺陷、氧化应激、铁死亡相关改变、多巴胺能信号扰动及运动异常，6PPD-Q可损伤认知行为、触发神经炎症并通过线粒体功能障碍加剧α?突触核蛋白预成型纤维诱导的Lewy神经突形成，且在PD患者CSF中检出更高水平6PPD-Q，但6PPD/6PPD-Q与AD/PD发病的关系仍属未充分探索领域：多数研究聚焦单一端点或通路，未捕捉多通路、多细胞类型互作网络；两者在分子起始事件、关键毒靶及优势信号通路的差异不清；AD与PD暴露—响应网络中的共享靶标与疾病特异性模块缺乏直接比较。为此，研究人员开展本研究，通过整合网络毒理学、分子对接、转录组验证及体内外实验系统表征6PPD与6PPD-Q的神经毒性互作网络及其与AD、PD的关联，比较两者靶标谱、关键信号通路及共享网络节点，为评估其对中枢神经系统风险、生物标志物筛选及化学品风险评估提供机制框架。论文发表于《Toxics》。

关键技术方法如下：研究人员采用ProTox 3.0平台进行计算机毒性谱预测；从SwissTargetPrediction、TargetNet、ChEMBL、STITCH四个数据库收集6PPD与6PPD-Q的预测靶标并标准化为基因符号；从GeneCards获取AD与PD疾病相关基因（阈值得分≥5.0），取化合物靶标与疾病基因交集作为潜在神经毒靶标；利用STRING数据库构建蛋白?蛋白互作(PPI)网络（置信度>0.40），Cytoscape加cytoHubba插件以最大团中心性(MCC)算法筛选枢纽靶标；Metascape进行GO与KEGG富集及MCODE模块分析；从GEO获取临床转录组数据集（AD：GSE5281；PD：GSE8397），用R语言limma或DESeq2做差异表达分析并与网络靶标交集验证核心靶标；AutoDock Vina实施分子对接（蛋白预处理用PyMOL与AutoDockTools），结合能

研究结果部分保留小标题与结论如下。2.1节“6PPD与6PPD-Q对器官毒性的毒性分析”：ProTox 3.0预测两者均有潜在神经毒性，6PPD还提示呼吸道毒性，6PPD-Q毒性更集中于中枢神经系统；BBB透过概率预测值为6PPD 0.84、6PPD-Q 0.65，支持其直接影响神经组织。2.2节“6PPD对AD的影响”：6PPD预测靶标213个与AD基因交集145个；PPI网络MCODE模块富集于p75NTR受控蛋白水解(R-HSA-193692)及AD特异通路(WP5124)，全局GO/KEGG富集于AGE-RAGE通路(WP2324)、脂质响应(GO:0071396)、激素刺激响应(GO:0032870)、凋亡信号调控(GO:2001233)等；MCC排名前15枢纽基因中用AD数据集GSE5281验证得9个差异表达核心靶标：CYCS、EGFR、HIF1A、MAP2K1、MAPK8、NFE2L2、NFKB1、PPARG、SRC。2.3节“6PPD对PD的影响”：6PPD靶标与PD基因交集121个；MCODE模块富集于p75NTR蛋白水解(R-HSA-193692)及PID P75 NTR通路(M153)、maresin类促消退脂介质生物合成(R-HSA-9027307)；全局富集于脂质与氮化合物响应(GO:1901699)、炎症响应调控(GO:0050727)、氧化应激响应(GO:0006979)、凋亡信号(GO:2001233)；MCC前15靶标用PD数据集GSE8397验证得7个核心靶标：CYCS、EGFR、ESR1、HIF1A、MAP2K1、MAPK8、MMP9。2.4节“6PPD在AD与PD中诱导核心靶标的分子对接”：AD与PD核心靶标交集为CYCS、EGFR、HIF1A、MAP2K1、MAPK8共5个；对接结合能分别为MAP2K1 ?7.1、EGFR ?6.8、HIF1A ?6.8、MAPK8 ?6.6、CYCS ?6.4 kcal/mol，均具有利亲和力与氢键、疏水互作。2.5节“6PPD-Q对AD的影响”：6PPD-Q预测靶标165个与AD基因交集120个；MCODE模块富集于内体TLR(toll样受体)转运加工(R-HSA-1679131)、MAPK级联正调控(GO:0043410)、NOTCH3非经典激活(R-HSA-9017802)、Aβ形成(GO:0034205)；全局富集于蛋白磷酸化(GO:0006468)、MAPK级联正调控、氮化合物与异物(xenobiotic)响应等；MCC前15靶标用GSE5281验证得6个核心靶标：BRAF、CYCS、GSK3B、JAK2、MAP2K1、MAPK14。2.6节“6PPD-Q对PD的影响”：6PPD-Q靶标与PD基因交集100个；MCODE模块富集于内体TLR加工与MAPK级联、Oncostatin M信号(WP2374)、Aβ形成；全局富集于生长因子受体与第二信使信号转导(R-HSA-5663202)、氧化应激响应、异物响应、白细胞介素(IL)信号等；MCC前15靶标用GSE8397验证得5个核心靶标：BRAF、CYCS、GSK3B、HDAC1、MAP2K1。2.7节“6PPD-Q在AD与PD中诱导核心靶标的分子对接”：AD与PD核心靶标交集为BRAF、GSK3B、MAP2K1、CYCS共4个；对接结合能分别为BRAF ?8.5、GSK3B ?8.5、MAP2K1 ?8.2、CYCS ?7.6 kcal/mol，均具强稳定结合与氢键、疏水互作。2.8节“6PPD与6PPD-Q核心靶标的整合分析”：GO比较显示两者靶标均关联内在凋亡信号通路，但上游不同——6PPD富集于轴突再生、轴突损伤响应，6PPD-Q富集于miRNA代谢过程（HIF1A、NFKB1连接内在凋亡项）；KEGG比较显示共同扰动代谢—免疫相关通路（内分泌抵抗、脂质与动脉粥样硬化、PD-L1 checkpoint），特异性上6PPD富集于氧化应激相关（化学致癌、活性氧(ROS)通路），6PPD-Q富集于神经退行性疾病、趋化因子、神经营养因子相关信号；两化合物神经退行相关核心靶标交集为CYCS与MAP2K1两个绝对共享节点，合并靶标PPI密集枢纽含EGFR、JAK2、MAPK14、NFKB1、PPARG、HIF1A等，映射至受体酪氨酸激酶(RTK)或MAPK信号及脂质驱动炎症等通路。2.9节“6PPD与6PPD-Q神经毒性的体内实验验证”：C57BL/6小鼠40天暴露后，Western blot显示两组Cleaved-Caspase 3上调、凋亡激活；RT?qPCR显示CYCS显著升高，MAP2K1无显著转录变化，MAPK8与EGFR主要在6PPD组上调，HIF1A无变化，BRAF两组均下调，GSK3B两组均上调；脑内炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ均显著升高。2.10节“6PPD与6PPD-Q诱导氧化应激与神经炎症的体外验证”：BV2小胶质细胞活力呈剂量依赖性下降；两组均致ROS大量累积；炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ显著上调，且6PPD-Q对IL-1β与IFN-γ的上调强于6PPD。

讨论部分总结：研究人员指出环境化学暴露是氧化应激与神经炎症的风险因素，但起始分子靶标难界定；6PPD与6PPD-Q具高BBB透过概率（0.84与0.65），亲脂性助其进入脑实质并在富含脂质的神经组织蓄积，体内实验证实两者突破全身防御致脑内凋亡与炎症改变。网络分析与实验显示两者机制有别又相连：6PPD主要作为神经元结构完整与氧化稳态的基础破坏者，富集于轴突再生、AGE-RAGE、p75NTR蛋白水解，体内上调EGFR、MAPK8，体外致ROS累积，提示慢性低剂量6PPD侵蚀神经元韧性、建立糖基化应激与脂质过氧化微环境；6PPD-Q则更具攻击性介入神经退行性疾病蛋白病变标志，靶标富集于内体TLR、MAPK级联、Aβ形成、非经典NOTCH3，对接显示强结合GSK3B与BRAF（?8.5 kcal/mol），动物实验验证GSK3B mRNA上调，提示6PPD-Q可直接劫持激酶网络加速神经毒蛋白聚集，且TLR过度激活引发小胶质细胞“细胞因子风暴”（体外6PPD-Q更强诱导IL-1β、IFN-γ，脑内TNF-α、IL-6、IL-1β激增），形成自我维持神经炎症循环。尽管上游不同，全局神经毒谱收敛于共享执行通路：CYCS与MAP2K1为两化合物绝对共享核心节点——MAP2K1是MAPK级联不可缺中枢转导器，CYCS胞浆释放是线粒体功能障碍不可逆内在凋亡执行标志；实验证实两组CYCS mRNA升高、Cleaved-Caspase 3上调、Bax/Bcl-2失衡，确认轨迹汇合于灾难性线粒体凋亡相关通路。研究人员提出协同神经毒模型：真实环境中两者以动态混合物存在，6PPD先致慢性初始打击（脂质驱动氧化应激、轴突再生受损、神经元脆弱基线），继而6PPD-Q趁 compromised细胞状态给与灾难性二次打击（直接结合并异常激活GSK3B等激酶、引发小胶质细胞不可控炎症风暴、加速病理蛋白聚集、促成CYCS释放与神经元死亡）。局限包括分子对接为静态快照，需全原子分子动力学模拟验证热力学稳定性；动物每组n=5基于大效应先验功效分析，但更小效应或个体变异需更大队列独立重复；缺乏AD/PD特异蛋白病变直接检测（如tau超磷酸化、Aβ斑块、α?突触核蛋白聚集）需转基因慢性暴露模型及人脑尸检样本；体外只用BV2小胶质细胞与全脑样本，未用神经元系（SH-SY5Y、HT22）、原代神经元、多巴胺能模型或共培养，AD/PD特异蛋白病变结论依赖in silico、转录组与体内脑组织分析，未来需神经元模型直接验证Aβ与α?突触核蛋白效应。但本研究仍表明6PPD与6PPD-Q是神经退行性疾病潜在协同驱动因子，强调需更安全的工业化学品替代物。

结论部分翻译：本研究表明6PPD与6PPD-Q具密切关联AD与PD发病的神经毒性。通过整合网络毒理学、分子对接、转录组验证与实验方法，研究人员证实两者均穿越BBB并触发脑内氧化应激、神经炎症、线粒体功能障碍及凋亡相关信号。6PPD主要损害轴突完整性与氧化—脂质稳态，而6PPD-Q更激进地经由GSK3B及TLR/MAPK通路促进蛋白病变与小胶质细胞激活。CYCS与MAP2K1是关键共享节点。这些结果提供了关联轮胎磨损污染物与神经退行性疾病风险的机制证据，并凸显迫切需用更安全替代品取代6PPD。未来需慢性暴露研究与人相关模型验证这些发现。

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