多种食品添加剂单独和联合暴露在人细胞中诱导的脂质代谢效应

《Toxics》：Lipid Metabolic Effects Induced by Individual and Combined Exposure to Multiple Food Additives in Human Cells

　　

随着多种食品添加剂的广泛共存，其联合暴露引发了日益增长的健康担忧。本研究采用高内涵成像（High-Content Imaging, HCI）技术，在HepG2、Caco-2和Jurkat T细胞中探究了五种常见食品添加剂单独及联合暴露对脂质代谢的影响。在HepG2和Caco-2细胞中，所有添加剂均剂量依赖性地诱导脂质和游离胆固醇积累；相比之下，Jurkat T细胞仅显示出零星统计学差异，未出现具有生物学意义的剂量依赖性效应。值得注意的是，脂滴积累表现为相对早期且易于检测的反应，但其作为代谢紊乱确证生物标志物的适用性仍需进一步验证。研究人员在HepG2和Caco-2细胞中开展的联合暴露实验揭示了细胞特异性相互作用模式：HepG2细胞中主要为相加效应，而Caco-2细胞中苯甲酸钠和环己氨基磺酸钠表现出协同性脂质紊乱作用。这些结果提供了体外证据，表明多组分联合暴露可引起细胞特异性的脂质相关扰动，而单添加剂评估无法全面捕捉这种效应，提示应将混合物毒性模型纳入食品安全评估体系以改进现有方法。

**研究背景与目的**
食品添加剂在现代食品工业中不可或缺，用于改善感官品质和延长保质期，但超加工食品的全球消费增长导致甜味剂（如阿斯巴甜、环己氨基磺酸钠、糖精钠）、防腐剂（苯甲酸钠）和着色剂（柠檬黄）等复杂添加剂体系频繁共存于各类食品中。以非酒精饮料为例，消费者通过日常膳食不可避免地同时摄入多种添加剂。然而，传统食品安全风险评估和监管框架主要基于单一组分，无法充分揭示多组分联合暴露的潜在健康危害。累积流行病学与实验证据已指出，这些添加剂类别存在致癌性、生殖毒性、代谢紊乱等风险；例如，国际癌症研究机构（IARC）将阿斯巴甜列为2B类致癌物，苯甲酸钠在特定条件下可生成苯（1类致癌物），柠檬黄与儿童行为障碍相关。尽管如此，全球尚未建立统一的体外评估体系来系统评价多组分联合暴露效应，且当前模型无法量化协同、相加或拮抗等复杂化学相互作用。因此，亟需采用基于人类相关的新方法学（New Approach Methodologies, NAMs）——整合人源细胞模型、器官芯片和计算毒理学并遵循3R原则——来弥补传统动物实验的伦理、成本及种属外推局限。本研究旨在比较五种常见食品添加剂在多种人细胞模型（肝细胞HepG2、肠上皮细胞Caco-2、T淋巴细胞Jurkat T）中的单独及联合效应，并基于脂质代谢相关表型提供体外证据，推动混合物毒性模型在食品安全评价中的应用。该论文发表在《Toxics》。

**主要技术方法**
研究人员采用高内涵成像（High-Content Imaging, HCI）技术，基于Filipin III（标记游离胆固醇）和脂滴染料（标记中性脂质）对处理后的细胞进行荧光染色，通过ImageXpress Micro共聚焦系统采集图像并用MetaXpress软件进行分割和分析，以平均染色面积（Mean Stain Area, MSA）定量脂质相关表型变化。随后利用欧洲食品安全局（EFSA）推荐的基准剂量（Benchmark Dose, BMD）建模方法（R包PROAST）计算BMD₁₀值及其95%置信区间（BMDL/BMDU），并结合等效应图法（isobologram analysis）判定联合暴露的相互作用类型（相加、协同或拮抗）。细胞系来源：HepG2（中国科学院细胞库）、Caco-2（中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心）、Jurkat T（ATCC）。所有实验设置溶剂对照，每个浓度至少3次独立重复。

**研究结果**
**3.1 单独食品添加剂对多种细胞模型脂质代谢的影响**
**3.1.1 HepG2细胞**：在0–1 mM浓度范围内（基于人群生物监测和临床药代动力学数据选定，无细胞毒性），五种添加剂均剂量依赖性地显著诱导游离胆固醇积累（Filipin染色，p < 0.001）和脂质积累（脂滴染色，p < 0.001），且脂质积累幅度大于游离胆固醇。阿斯巴甜、苯甲酸钠和环己氨基磺酸钠的诱导效应强于糖精钠和柠檬黄。
**3.1.2 Caco-2细胞**：与HepG2类似，所有添加剂在0–1 mM下剂量依赖性地诱导游离胆固醇和脂质积累（均p < 0.001），脂质积累幅度更大。低浓度（≤0.0625 mM）时阿斯巴甜、苯甲酸钠和环己氨基磺酸钠效应更强，高浓度（≥0.5 mM）时柠檬黄和糖精钠效应更显著。
**3.1.3 Jurkat T细胞**：在静息态和经PMA/离子霉素激活态下，五种添加剂仅产生零星统计学差异，无单调剂量-反应关系，未引起具有生物学意义的游离胆固醇或脂滴积累变化。这表明食品添加剂对脂质代谢的干扰具有细胞类型特异性，与代谢细胞（肝细胞、肠细胞）和免疫细胞的功能差异相关。
**3.2 食品添加剂混合物对脂质积累的联合效应**
基于脂滴（LD）积累比游离胆固醇更敏感，且HepG2和Caco-2细胞中所有添加剂均呈稳定剂量依赖趋势，选择脂滴积累作为联合暴露终点。在HepG2细胞中，苯甲酸钠、环己氨基磺酸钠和阿斯巴甜（三个BMD₁₀最低的添加剂）两两组合的混合物LD-BMD₁₀值均低于单一组分，等效应图分析显示所有数据点落在相加域（BMD₁₀线与BMDL线之间），表明均为相加效应。在Caco-2细胞中，阿斯巴甜与环己氨基磺酸钠、阿斯巴甜与苯甲酸钠组合呈相加效应；而苯甲酸钠与环己氨基磺酸钠组合的数据点落在协同域（低于BMDL线），呈现协同干扰作用。这种细胞特异性相互作用模式与肠道细胞作为首过代谢界面的高敏感性以及肝细胞的稳态缓冲能力一致。

**讨论与结论**
讨论部分指出：脂滴积累作为更敏感的早期表型指标，源于其动态可塑性优于受严格稳态调控的胆固醇分布。细胞类型特异性响应反映了代谢细胞与免疫细胞在脂质代谢功能上的根本差异——代谢细胞专司脂质处理和储存，而T细胞主要将脂质用于信号传导和膜动力学。在联合暴露中，HepG2中普遍存在的相加效应提示肝脏脂质反应可能遵循剂量相加范式，而Caco-2中苯甲酸钠与环己氨基磺酸钠的协同效应表明低剂量共暴露即可引发单添加剂毒性数据无法预测的脂质异常表型，这对现有基于单一组分每日容许摄入量（ADI）的风险评估框架构成挑战。研究局限性包括：所有细胞均为永生化转化细胞系而非原代人细胞或完整组织；仅涵盖有限组合和浓度场景；高内涵成像数据仅反映脂滴和游离胆固醇染色模式变化，未直接测量脂质代谢通量或组分。
**结论翻译**：总之，本多细胞模型研究表明，多种食品添加剂（包括阿斯巴甜、苯甲酸钠、环己氨基磺酸钠、糖精钠和柠檬黄）的联合暴露可在HepG2和Caco-2细胞系中诱导明显的脂质相关异常细胞表型。在本研究所评估的特定实验条件、终点和细胞系统中，脂滴（LD）积累比游离胆固醇染色更敏感地指示化学诱导的脂质相关表型异常，支持其在食品添加剂安全性评估中作为体外筛选工具的潜在用途。两两组合暴露揭示了细胞特异性相互作用模式：HepG2细胞中以相加效应为主，而Caco-2细胞中苯甲酸钠-环己氨基磺酸钠组合表现出协同效应。这些发现强调，在所测试剂量下，食品添加剂联合暴露会诱导出当前单一组分风险评估框架无法捕获的独特脂质相关细胞表型变化，凸显了将混合物毒性评价纳入未来食品安全研究和法规制定的关键必要性。