《Journal of Fungi》：Identification of Circadian Clock Homologs and Their Rhythmic Expression Differences Among Mating-Type Strains in Morchella sextelata
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生物钟（circadian clock）是一种在生物体中广泛存在的节律现象，其特征是在一天特定时间具有不同的基因表达模式和行为。在模式真菌粗糙脉孢菌（*Neurospora crassa*）中开展的广泛遗传学研究，为揭示昼夜振荡器（circadian osci
生物钟（circadian clock）是一种在生物体中广泛存在的节律现象，其特征是在一天特定时间具有不同的基因表达模式和行为。在模式真菌粗糙脉孢菌（*Neurospora crassa*）中开展的广泛遗传学研究，为揭示昼夜振荡器（circadian oscillator）的组分和分子机制提供了关键见解。然而，这些认知在真菌谱系中仍然缺失，尤其是在食用菌中。羊肚菌（*Morchella* spp.）是公认的具有重要经济价值的可食子囊菌，且部分已实现人工栽培，但其生物学特性了解甚少。研究其生物钟组分的存在以及昼夜节律（circadian rhythm）的分子基础具有重要的生物学意义。在本研究中，研究人员首次对六线羊肚菌基因组进行了已知生物钟基因同源物的搜索。共鉴定了七个生物钟基因的同源物，包括 *wc-1*、*wc-2*、*fwd-1*、*frh*、*frq* 以及另外两个钟控基因（clock-controlled gene, *ccg*），表明六线羊肚菌含有FWC振荡器（FWC oscillator）运作所需的组分。随后，研究人员使用逆转录定量PCR（reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR），在体外培养条件下，于分生孢子形成（conidiation）期间的一天中，从MAT1-1、MAT1-2以及MAT1-1 × MAT1-2共培养/交叉状态菌丝体提取的RNA样本中，检测了这七个生物钟相关基因和四个交配型基因的表达谱。七个生物钟基因和四个交配型基因的表达水平显示出相似的、特定时间依赖性的节律模式，但在不同交配型菌株及其共培养/交叉状态中始终存在显著差异，表明生物钟与交配型基因座（mating-type loci）之间可能存在潜在关联。综合而言，这些结果表明六线羊肚菌含有保守的生物钟相关同源物，并在所测试的分生孢子形成条件下表现出交配型相关的时间表达差异，为未来探索钟相关调控与交配型背景之间的潜在联系提供了新视角。
**研究背景、问题与研究意义**
生物钟（circadian clock）是一种内源性计时系统，通过与外界环境信号同步，以约24小时周期振荡协调生物体的基因表达、生理和行为。在真核生物中，生物钟依赖转录-翻译反馈环（transcription-translation feedback loop, TTFL）运作，模式真菌粗糙脉孢菌（*Neurospora crassa*）的FRQ/WCC振荡器（FRQ/WCC oscillator）是研究最深入的模型之一。然而，除粗糙脉孢菌外，其他真菌尤其是食用菌的生物钟研究极为有限。羊肚菌（*Morchella* spp.）作为经济价值高的可食子囊菌，其产量和品质与子实体发育事件（如菌丝生长、分生孢子形成、原基形成和子实体成熟）及环境周期的协调密切相关，因此研究其生物钟具有理论和实践意义。此外，不同交配型菌株（MAT1-1与MAT1-2）及其共培养/交叉状态下昼夜节律是否受调控尚不清楚，交配型菌株间的节律性比较也鲜有报道。本研究旨在鉴定六线羊肚菌（*Morchella sextelata*）基因组中的生物钟相关同源物，并检测其在不同交配型背景下的时序表达模式，以探讨生物钟与交配型调控的潜在关联。
**研究内容、结论与意义**
研究人员通过基因组搜索鉴定了六线羊肚菌中七个生物钟基因同源物（*wc-1*、*wc-2*、*fwd-1*、*frh*、*frq*、*ccg-8*、*ccg-9*），证实其含有FWC振荡器运作所需的保守组分。进一步利用逆转录定量PCR（RT-qPCR）检测了这些基因及四个交配型基因（*MAT1-1-1*、*MAT1-1-10*、*MAT1-1-11*、*MAT1-2-1*）在MAT1-1、MAT1-2及MAT1-1 × MAT1-2共培养/交叉状态下一天8个时间点的表达谱。结果显示，这些基因在各菌株内呈现一致的节律性表达模式，但不同菌株间模式显著不同，提示生物钟可能与交配型基因座存在关联。结论表明六线羊肚菌拥有保守的生物钟核心组分，并表现出交配型相关的节律性表达差异，为真菌时间生物学进化框架提供了新认识，并为优化羊肚菌生长和子实体生产提供了潜在价值。论文发表在《Journal of Fungi》。
**关键技术方法**
主要技术方法包括：（1）基因组同源性搜索：以粗糙脉孢菌等真菌中已鉴定的17个生物钟相关基因作为查询序列，使用BLASTX在六线羊肚菌基因组数据库中搜索同源物，以E值<1×10
-10、覆盖率>25%和一致性>30%为筛选标准；（2）内参基因验证：通过BestKeeper算法评估*actin1*、延伸因子1-α和β-微管蛋白三个候选内参基因的稳定性，选择*actin1*作为RT-qPCR归一化内参；（3）基因表达分析：采用RT-qPCR检测11个目标基因在MAT1-1、MAT1-2及MAT1-1 × MAT1-2共培养/交叉状态（菌株源自中国采集的野生子实体，经单子囊孢子分离获得）下分生孢子形成阶段的表达谱，每3小时取样一次，共24小时，使用2
-ΔΔCt法计算相对表达量。
**研究结果**
**3.1 MAT1-1、MAT1-2及MAT1-1 × MAT1-2共培养的分生孢子形成比较**
通过观察MS培养基上24天培养的菌落形态发现，MAT1-1和MAT1-2单菌株仅在培养基上散落零星分生孢子，而MAT1-1 × MAT1-2共培养/交叉状态下，两菌株接触区域密集形成分生孢子簇，提示共培养促进了分生孢子产生，但异核体形成未能直接验证。
**3.2 六线羊肚菌中生物钟基因同源物的鉴定**
使用BLASTX搜索六线羊肚菌基因组，鉴定了四个核心生物钟基因（*wc-1*、*wc-2*、*frh*、*frq*）和一个钟基因（*fwd-1*）的同源物，序列一致性为30.85%–61.04%。此外，从九个钟控基因（*ccgs*）中鉴定出五个同源物（*ccg-8*、*ccg-9*、*ccg-15*、*ccg-16*、*ccg-14*），但因覆盖率低，仅*ccg-8*和*ccg-9*被进一步研究。未找到*ccg-1*、*ccg-4*、*ccg-6*、*ccg-13*、*mfa-1*、*pre-1*和*pre-2*的同源物。结果表明六线羊肚菌含有FWC振荡器所需组分及输出途径相关基因。
**3.3 RT-qPCR归一化候选内参基因的验证**
BestKeeper分析显示，*actin1*、延伸因子1-α和β-微管蛋白的SD值均低于1，表达稳定性可接受。其中*actin1*具有最低SD值和与BestKeeper指数的高相关性，因此被选为后续RT-qPCR归一化的内参基因。
**3.4 七个生物钟基因同源物在MAT1-1、MAT1-2及共培养中的表达模式**
**3.4.1 MAT1-1菌株中七个生物钟基因同源物的表达模式**
七种同源物在ZT12:00（正午）达到一个高表达峰，在ZT15:00为低表达谷；*ccg-8*、*frh*和*frq*在ZT0:00（黎明）出现第二个峰，*fwd-1*在ZT3:00出现第二峰；*wc-1*、*wc-2*和*ccg-9*则在ZT12:00后于ZT18:00、ZT0:00和ZT6:00出现多个峰。单因素方差分析表明，*ccg-8*、*frh*、*frq*和*ccg-9*的节律性变化显著，而*fwd-1*、*wc-1*和*ccg-9*不显著，但整体呈现约12小时周期。
**3.4.2 MAT1-2菌株中七个生物钟基因同源物的表达模式**
七种同源物的表达模式与MAT1-1完全不同，未呈现明显规律性振荡，仅显示一个宽缓的表达峰。*ccg-8*、*frh*、*frq*和*fwd-1*的表达水平持续高于*wc-1*、*wc-2*和*ccg-9*。方差分析显示*ccg-8*、*frh*、*frq*、*fwd-1*和*wc-2*节律性显著，*wc-1*和*ccg-8*不显著，整体呈约24小时周期。
**3.4.3 MAT1-1 × MAT1-2共培养/交叉条件下七个生物钟基因同源物的表达模式**
七种同源物的表达模式与单菌株完全不同，但彼此间高度一致：除*wc-2*在ZT21:00外，其余均在ZT18:00（黄昏）达到最高峰，ZT0:00为最低谷（*ccg-9*在ZT3:00最低）。方差分析仅*frh*和*frq*的节律性显著，其余不显著，但所有基因的峰相位一致。
**3.4.4 MAT1-1、MAT1-2及共培养间表达模式比较**
三种条件下，七种生物钟基因同源物的表达模式总体不同：MAT1-1中呈现多峰；MAT1-2中为宽缓单峰；共培养中为尖锐单峰。各菌株内四种基因（*ccg-8*、*frh*、*frq*、*fwd-1*）与另三种（*wc-1*、*wc-2*、*ccg-9*）在MAT1-1和MAT1-2中部分相似但仍有差异，而在共培养中则近乎完全一致。
**3.5 四个交配型基因在MAT1-1、MAT1-2及共培养中的表达模式**
**3.5.1 MAT1-1菌株中三个交配型基因的表达模式**
*MAT1-1-10*和*MAT1-1-11*呈现相同的12小时节律，在ZT12:00和ZT0:00出现峰，ZT15:00和ZT3:00为谷。*MAT1-1-1*在ZT12:00出现峰，但ZT21:00后模式与另两个基因不同。方差分析显示*MAT1-1-1*和*MAT1-1-11*节律性显著，*MAT1-1-10*不显著。
**3.5.2 MAT1-2菌株中一个交配型基因的表达模式**
*MAT1-2-1*的表达模式与MAT1-1中的三个基因完全不同，未呈现规则波动，在ZT6:00出现陡峭谷。方差分析显示其节律性显著。
**3.5.3 MAT1-1 × MAT1-2共培养中四个交配型基因的表达模式**
四种交配型基因的表达模式与单菌株完全不同。*MAT1-1-10*和*MAT1-1-11*仍呈现一致节律，但与*MAT1-1-1*不同。*MAT1-2-1*的表达模式与MAT1-2菌株相反，在ZT12:00出现最低谷。方差分析仅*MAT1-1-1*节律性显著，其余不显著。
**3.5.4 MAT1-1、MAT1-2及共培养间表达模式比较**
四种交配型基因在共培养中的表达模式与单菌株完全不同。MAT1-1菌株中*MAT1-1-10*和*MAT1-1-11*呈12小时节律，而*MAT1-1-1*、*MAT1-2-1*以及共培养中的四个基因未显示清晰规则节律，周期未知。
**3.6 MAT1-1、MAT1-2及共培养中11个基因表达模式的比较**
无论考虑所有基因还是仅显著节律性基因，每个菌株内七个生物钟同源物与四个交配型基因的表达模式高度一致。*frh*和*frq*在三种条件下均有显著节律，*MAT1-1-1*在MAT1-1和共培养中显著。总体表明六线羊肚菌可能存在内源性生物钟调控分生孢子形成，但其节律因交配型背景而不同。
**讨论总结**
本研究在六线羊肚菌中首次鉴定了生物钟核心组分，并证明其在不同交配型菌株中呈现不同的节律性表达模式。与模式真菌粗糙脉孢菌相比，六线羊肚菌的基因表达峰数量和峰时间随交配型不同而变化：MAT1-1菌株出现多峰，MAT1-2为宽缓单峰，共培养为尖锐单峰（黄昏峰），后者与粗糙脉孢菌的典型单峰更相似。共培养条件下基因表达模式高度一致，暗示交配型间的相互作用可能重新组织生物钟调控，以协调生殖过程。*MAT1-1-1*、*MAT1-1-10*和*MAT1-1-11*的表达峰与核心生物钟基因大致一致，提示这些交配型基因可能参与钟相关调控及分生孢子发育。而*MAT1-2-1*在MAT1-2菌株中节律显著但与生物钟基因不同调，在共培养中不显著且模式相反，可能缺乏生物钟相关节律性。内参基因验证确认*actin1*为最稳定选择。
**研究结论翻译**
总之，本研究表明六线羊肚菌中的核心生物钟组分在进化上保守，并表现出独特的节律性表达模式。这些发现丰富了真菌时间生物学的进化框架，并为探索生物钟与交配型调控之间的潜在关联提供了新视角，从而进一步推进了对真菌生物钟调控机制的理解。由于羊肚菌属物种的稳定高效遗传操作体系仍面临技术挑战，一旦此类体系建立，应开展反向遗传学研究以阐明核心生物钟基因的精确功能。未来研究应纳入更多不同交配型菌株及其相应的共培养/交叉组合，以验证昼夜节律与交配型背景之间的关系。此外，操作生物钟基因对于优化羊肚菌的生长和子实体生产具有潜在价值。进一步探索这些策略将有利于该重要食用菌在食品工业中的高效栽培和工业应用。
