一种用于实时监测脂质纳米颗粒组装的时间分辨原位小角X射线散射方法

《Membranes》：A Time-Resolved In Situ SAXS Method for Real-Time Monitoring of Lipid Nanoparticles Assembly

　　

脂质纳米颗粒(LNP)已成为热门的核酸递送系统，然而由于其自组装与结构成熟相关的动态机制受限于传统离线表征工具而尚未被充分理解。本研究建立了一种时间分辨(TR)原位小角X射线散射(SAXS)方法，以监测LNP在微流控制备及后续成熟过程中的结构演化。通过将双通道微流控混合系统与SAXS测量平台集成，研究人员成功捕获了空LNP与信使RNA负载纳米颗粒(mRNA-LNP)的实时散射曲线。结果表明，空LNP与mRNA封装LNP具有不同的组装路径：空LNP经历向周期性纳米结构的逐渐转变，而mRNA-LNP表现出快速复合为稳定亚基继而发生层级组装的过程。此外，该平台有效追踪了微流控稀释过程中的纳米尺度结构重排，表现为散射峰与内部周期性的细微偏移。总体而言，该时间分辨方法提供了一个稳健的实验框架，用于捕获瞬态中间态，为阐明分子组装机制并促进下一代纳米药物的理性设计提供了有价值的工具。

该研究发表于《Membranes》。脂质纳米颗粒（LNP，lipid nanoparticle）作为主流核酸递送系统在mRNA疫苗等领域取得重大成功，其生物性能（内体逃逸、转染效率等）高度依赖于内部纳米结构（如层状相、反六方相等液晶介观相），而“结构–功能”关系是理性设计下一代LNP的核心。目前LNP表征主要依赖动态光散射（DLS，Dynamic Light Scattering）、冷冻电镜（Cryo-EM，cryogenic Electron Microscopy）、小角中子散射（SANS，Small-Angle Neutron Scattering）等离线（ex situ）技术，这些手段虽可提供终产物高分辨快照，但存在采样偏差与时间滞后效应，无法捕捉LNP自组装发生在秒至毫秒级尺度的瞬态中间态与动力学路径。小角X射线散射（SAXS，Small-Angle X-ray Scattering）虽已用于平衡态LNP结构解析，但其在制备与成熟阶段实时原位监测的潜力尚未充分开发。因此研究人员开展本研究，旨在建立时间分辨（TR，time-resolved）原位SAXS平台集成微流控混合系统，以实时追踪LNP初始组装与后续成熟过程中的纳米结构演化，明确空LNP与mRNA-LNP的不同组装机制，并监测模拟透析（稀释、pH转变）引发的结构重排，从而为LNP配方筛选、工艺参数优化及理性设计提供分子水平的动态实验依据。研究结论表明该TR-SAXS平台能以1 s帧?1时间分辨（可降至3 ms）可靠捕获两类LNP的不同组装路径与稀释过程中的d-间距变化，平台连续流、非侵入，可与连续制造（CM，Continuous Manufacturing）和过程分析技术（PAT，Process Analytical Technology）框架对接，为纳米药物制备中瞬态中间态捕捉与关键工艺参数优化提供了实用工具。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：在同步辐射SAXS束线（BL19U2，SSRF）搭建集成双通道微流控注射泵系统与薄壁石英毛细管检测池的原位TR-SAXS平台；分别通过离线批量模式SAXS（束线同参数，石英毛细管进样，曝光1 s/帧，20帧平均）与在线微流控组装同步采集（先单相润洗毛细管，再双相按流速比FRR=3:1、总流速TFR=3.6 mL/min启动混合并连续采集SAXS帧）来获得空LNP与mRNA-LNP的结构演化数据；通过离线制备粗LNP后再在线微流控稀释（PBS pH 7.4与粗LNP按流速比3:1混合模拟透析pH转变）并连续采集SAXS追踪结构重排；采用BioXTAS RAW软件进行SAXS数据预处理，通过布拉格方程d=2π/q计算内部周期d-间距，利用Guinier区拟合回转半径（R_g，radius of gyration），通过Porod规律分析界面特征，并由峰位比指认反六方（H_II）等高序Bragg峰。

研究结果

3.1. 离线法与在线法制备LNP的可比性：研究人员先以标准离线微流控制备空LNP与mRNA-LNP，用批量SAXS表征；再以相同参数在TR-SAXS平台上在线制备并收集毛细管出口产物做批量SAXS对比。结果显示两种方法所得SAXS曲线高度重叠，峰位与散射特征一致；mRNA-LNP完全重叠，空LNP低q强度在线略高于离线，归因于无mRNA结构稳定作用下空LNP在收集后数分钟内会从瞬态流致关联态弛豫到更稳定的平衡分散态。这表明集成微流控混合与毛细管检测的TR-SAXS平台不会改变LNP基本自组装与最终纳米结构，为后续原位观察奠定可靠基础。

3.2. LNP组装过程中的原位结构演化观察：研究人员用该平台实时监测微流控混合组装过程。空LNP在初始混合至稳定态间出现显著结构转变：约q~0.1 ??1特征散射峰逐渐增强、锐化，对应脂质混合物从无序态（附录图S1）逐步转变为定义明确的周期性纳米结构；最终阶段出现高阶Bragg峰，峰位比q₂:q₁等符合反六方液晶相（H_II）指标，证明平台能分辨纳米尺度精细结构过渡。空LNP初始态低q无Guinier平台、呈平缓衰减，反映空间未约束、无粒子间关联的分散态；终态低q有明显Guinier区，R_g约13.7~20.4 nm，说明形成紧凑单分散聚集体。mRNA-LNP则不同：q~0.1 ??1峰强度与位置在整个观测中基本稳定（对应内部周期~5.5 nm，为mRNA–可电离脂质复合亚基特征），表明mRNA与质子化MC3通过静电作用在毫秒级快速形成稳定亚基（超出当前1 s时间分辨），后续低q逐渐增强并出现球形粒子弱振荡特征，对应层级组装：先快速复合为稳定小亚基（尺度~5.5 nm），再与辅助脂质（DSPC、胆固醇、DMG-PEG2000）整合为更大、结构明确的纳米颗粒；终态高q（0.15–0.30 ??1）呈幂律衰减、Porod指数?3.8±0.2，接近理想?4，证实成熟mRNA-LNP具光滑锐界、致密整体形状；初始态低q有Guinier区（R_g~13.6~16.3 nm）显示亚基已结构稳定。

3.3. LNP稀释过程中的结构重排原位监测：研究人员以在线微流控稀释（粗LNP:PBS=1:3，模拟透析酸性→生理pH）追踪结构成熟。空LNP稀释时特征峰由q=0.11307 ??1微移至0.11182 ??1，d-间距由~5.5 nm略增至~5.6 nm，峰强略降，反映pH升高伴随长程有序度稍降低与脂双层矩阵微弱重排。mRNA-LNP变化更显著：峰由q=0.11693 ??1移至0.10996 ??1，d-间距由~5.3 nm扩至~5.7 nm；低q斜率散射强度渐增并出现弱振荡，表明mRNA–脂质亚基长大、最终形成完整LNP颗粒；整体演化幅度大于空LNP，凸显mRNA–脂质相互作用对生理条件下结构重塑的关键驱动。尽管稀释后信噪比降低，趋势仍清晰可辨。

讨论总结：研究人员在讨论中指出，所建同步辐射SAXS原位时间分辨平台集成微流控混合，能以1 s/帧（可低至3 ms）获取空与mRNA-LNP在组装与成熟阶段的实时散射信息；在线与离线结构一致性验证了平台代表性。结果显示空LNP逐渐产生q比符合反六方相的峰系列，指向向周期性纳米结构（反六方H_II）的渐变；mRNA-LNP则快速形成稳定亚基（q~0.1 ??1峰基本不变），低q强度逐渐增长反映层级组装；平台也捕捉到稀释（模拟透析）中散射峰细微位移（d-间距变化），表明LNP纳米结构对环境pH敏感。该TR-SAXS方法为捕获纳米药物制备中瞬态中间态提供了稳健框架，微流控芯片模块化可扩展至多级架构以提升通量，对接连续制造（CM）与过程分析技术（PAT）框架；可在实验室级或同步辐射SAXS下监测放大过程中LNP结构完整性与批间一致性，优化流速比、混合温度等关键工艺参数（CPP，Critical Process Parameters）；随高亮度实验室SAXS与自动化微流控发展，该方法有望桥接学术原型与工业实现；未来可联用互补表征技术深化LNP自组装机制理解。结论部分翻译：本工作中，研究人员建立了一种利用同步辐射SAXS监测LNP纳米尺度结构转变的原位时间分辨实验平台。通过将微流控混合系统与SSRF的BL19U2束线SAXS检测平台集成，成功捕获了空LNP与mRNA-LNP在初始组装及后续成熟阶段的实时散射曲线。所建平台可实现每帧1 s（可降至3 ms）的时间分辨实时数据采集；在线与离线制备的散射曲线高度一致验证了该在线方法的可靠性，确认TR-SAXS是在受控流动条件下研究LNP组装的代表性工具。原位实时观察揭示两类系统不同散射行为：空LNP呈现q比符合反六方相的散射峰渐次出现，指向向反六方相的过渡；mRNA-LNP则快速形成结构特征（q~0.1 ??1峰基本稳定），低q强度逐渐增长反映颗粒生长；平台还有效捕捉微流控稀释中散射峰位（d-间距）细微偏移，凸显LNP纳米结构对环境pH变化的敏感性。总之，该工作证明TR-SAXS是解析LNP系统动态结构演化的稳健有效方法，所开发平台为捕捉纳米药物制备中瞬态中间态提供了实用实验工具，可支持配方筛选与工艺优化。