《Biology》：Identification of Neuropeptide F (NPF) Signaling and Associated Regulation of Food Intake in the Dark Black Chafer Beetle Holotrichia parallela
编辑推荐：
黑绒鳃金龟是一种全球分布的土栖害虫，对中国花生栽培构成严重威胁。神经肽作为关键的信号分子，能够调控昆虫多种生理与行为过程，并且是极具前景的害虫防控靶标。迄今为止，黑绒鳃金龟中神经肽的功能特征尚未见报道。本研究分别分离并克隆了1个NPF和1个NPF受体（NPFR
黑绒鳃金龟是一种全球分布的土栖害虫，对中国花生栽培构成严重威胁。神经肽作为关键的信号分子，能够调控昆虫多种生理与行为过程，并且是极具前景的害虫防控靶标。迄今为止，黑绒鳃金龟中神经肽的功能特征尚未见报道。本研究分别分离并克隆了1个NPF和1个NPF受体（NPFR）基因。生物信息学分析表明，NPF基因可通过可变剪接产生两种转录本变体，即NPFa（255 bp）和NPFb（369 bp）。NPFR基因开放阅读框长度为1188 bp，编码395个氨基酸，含有7个α-螺旋跨膜结构域，表明其属于A家族G蛋白偶联受体（GPCR）家族。时空表达谱显示，NPF在成虫脑中表达最丰富，而NPFR在脑和触角中高度富集。NPF在2龄至3龄幼虫阶段表达达到峰值，而NPFR在卵期高表达。饥饿胁迫显著上调这两个基因的表达。RNA干扰（RNAi）介导的NPF和NPFR沉默显著降低了成虫摄食量、雌虫繁殖力以及糖原含量。这些结果增进了对昆虫神经肽信号网络的理解，并为开发基于行为调控的害虫防治策略提供了支持。
该论文发表于《Biology》，聚焦黑绒鳃金龟（Holotrichia parallela）神经肽F（NPF）信号系统的分子鉴定及其生理功能解析。黑绒鳃金龟是重要地下害虫，幼虫危害花生、玉米、甘薯等作物根部，成虫则具有独特的48 h节律性出土、取食与交配行为。长期以来，该虫主要依赖化学杀虫剂防治，但由此引发的抗药性、农药残留和生态风险问题日益突出，因此亟需寻找更安全、可持续的新型分子靶标。神经肽作为昆虫神经内分泌系统中的核心信号分子，广泛参与摄食、代谢、发育、生殖和行为调节，其中神经肽F（NPF）及其受体NPFR已在多种昆虫中被证明与食欲和能量稳态密切相关。然而，在黑绒鳃金龟中，该通路此前尚无分子与功能层面的系统研究。因此，研究人员围绕NPF/NPFR信号系统是否在这一具有双日节律特征的鞘翅目害虫中发挥保守的摄食调控功能这一关键问题，开展了系统研究。
研究人员首先完成了黑绒鳃金龟NPF与NPFR基因的克隆与鉴定，并证实NPF基因存在两种可变剪接转录本，即NPFa与NPFb。这一发现说明该物种的NPF系统具有一定的结构复杂性。进一步分析表明，NPFR编码典型的7次跨膜A家族G蛋白偶联受体（GPCR），符合昆虫神经肽受体的一般特征。表达谱分析显示，NPF主要在脑和中肠表达，NPFR则主要富集于脑、触角，并在中肠和精巢中也有一定表达。这种分布格局提示，该通路不仅参与中枢摄食调控，还可能涉及外周代谢调节及感觉相关过程。发育阶段分析发现，NPF在2龄后期和3龄幼虫中表达最高，而NPFR在卵期及1龄幼虫期表达较高，说明二者在不同生命阶段的功能侧重点并不相同。饥饿处理可显著诱导NPF和NPFR表达上调，提示该信号系统与营养缺乏状态下的摄食补偿和能量稳态维持密切相关。通过RNA干扰（RNAi）沉默NPF或NPFR后，成虫摄食量明显下降，雌虫产卵数减少，糖原储备下降，表明该信号系统在促进摄食、维持糖代谢以及支持繁殖方面发挥关键作用。论文由此得出结论：在黑绒鳃金龟中，NPF–NPFR信号通路是调控摄食行为、能量代谢和繁殖的重要神经内分泌模块，对后续开发行为调控型绿色防治策略具有重要意义。
在技术方法方面，作者主要采用了以下几类关键手段：其一，基于头部转录组数据进行同源序列检索，并结合RT-PCR、RACE和Sanger测序完成NPF与NPFR全长序列鉴定；其二，运用开放阅读框预测、信号肽预测、跨膜结构域分析、多序列比对和系统发育分析等生物信息学方法解析基因结构与进化关系；其三，以采自中国青岛花生田的黑绒鳃金龟为样本来源，采用RT-qPCR分析不同组织、不同发育阶段及胁迫条件下的表达模式；其四，利用双链RNA注射进行RNA干扰（RNAi），并结合摄食测定、存活与产卵统计以及糖原、海藻糖、游离脂肪酸（FFA）测定评估基因功能。
在研究结果部分，论文依次从多个层面展示了NPF/NPFR信号系统的分子和生理特征。
3.1. Molecular Characterization and Bioinformatic Analysis of NPF and NPFR Genes
研究人员在黑绒鳃金龟中鉴定到单拷贝NPF和NPFR基因。NPF经可变剪接产生两种转录本：NPFa为255 bp，NPFb为369 bp，其中NPFa缺失NPFb所含的第2外显子。两种前体均具有信号肽并形成成熟肽，C端都保留保守的RPRFamide基序，显示其属于典型昆虫NPF家族成员。NPFR开放阅读框为1188 bp，编码395个氨基酸，具有7个α-螺旋跨膜区，符合A家族GPCR特征。系统发育分析显示，黑绒鳃金龟NPF聚类于NPF1单系分支，NPFR则与其他金龟科昆虫受体亲缘关系最近，支持其在进化上的保守性。
3.2. Expression Pattern Analysis of NPF and NPFR in Different Developmental Stages and Tissues
通过RT-qPCR，研究人员发现NPF与NPFR具有显著的组织特异性和阶段特异性。NPF在成虫脑中表达最高，其次为中肠，说明其可能同时参与中枢神经调节和消化摄食相关调控。NPFR在脑中最高表达，在触角中也高度富集，提示其可能除参与摄食调控外，还与嗅觉感知相关。发育表达方面，NPF在2龄后期及3龄幼虫达到高峰，说明其与幼虫旺盛取食和能量需求密切相关；NPFR则在卵和1龄幼虫中高表达，提示其可能参与早期发育相关调节。
3.3. Effects of Stress Conditions on NPF and NPFR Transcript Level
高温与饥饿胁迫结果表明，该通路对环境变化具有响应性。短时高温胁迫对NPF转录水平影响不显著，但对NPFR具有明显调节作用，且存在性别差异：雌虫NPFR在36 °C下降，在39 °C恢复；雄虫NPFR在36 °C和39 °C均受到抑制，说明NPFR可能是该通路响应热胁迫的核心节点。相比之下，96 h饥饿处理显著上调雌雄成虫头部NPF和NPFR表达，表明该系统在营养匮乏状态下被激活，可能用于促进摄食与维持能量稳态。
3.4. Determination of RNAi Efficiency
研究人员合成dsNPF和dsNPFR并进行血腔注射，分别在注射后48、96、144和192 h检测沉默效率。结果显示，两基因在96 h时沉默效果最佳，且中肠中的沉默效率高于头部。NPF在头部和中肠分别下降81.05%和99.31%，NPFR分别下降73.50%和77.87%。这一结果为后续功能测定提供了可靠基础。
3.5. Effects of dsNPF and dsNPFR on Adult Food Consumption
在RNAi处理后第4天和第6天统计平均日摄食量，发现无论雌虫还是雄虫，沉默NPF或NPFR均显著降低摄食量，且两种处理之间差异不显著。这一结果直接证明，在黑绒鳃金龟中，NPF信号系统对成虫摄食行为具有正调控作用。
3.6. Effects of dsNPF and dsNPFR on Survival and Reproduction
存活分析显示，沉默NPF或NPFR在10 d观察期内均未显著影响雌雄成虫存活率，说明该通路并不决定短期成虫存活。与此相对，dsNPF处理显著降低单雌总产卵量，dsNPFR处理也表现出下降趋势但未达到显著水平。这说明NPF在繁殖调控中具有重要作用，其影响更可能体现在营养分配与产卵能力，而非通过改变成虫短期存活实现。
3.7. Effects of dsNPF and dsNPFR on Energy Metabolism in Adults
在96 h饥饿条件下，雌雄成虫糖原和海藻糖水平均显著下降，而游离脂肪酸（FFA）无显著变化，说明短期饥饿主要动员糖类能源。RNAi实验进一步表明，沉默NPF或NPFR会显著降低糖原含量，尤其在雌虫中更为明显；海藻糖变化不显著；雄虫沉默NPF后FFA显著升高。这表明NPF/NPFR信号通路参与成虫能量代谢调控，尤其与糖原储存或合成密切相关，并可能存在性别差异性的脂代谢响应。
论文讨论部分围绕该通路的保守性、功能多样性及其潜在应用价值进行了凝练阐述。研究首先指出，黑绒鳃金龟仅检测到1个NPF基因，但该基因可通过外显子跳跃形成NPFa和NPFb两种异构体，说明可变剪接是该神经肽系统功能多样化的重要分子基础。两种异构体均保留RPRFamide保守基序，但NPFb具有额外的N端延伸序列，提示二者在受体结合、信号转导效率或体内稳定性上可能存在差异，不过本文未对其成熟肽活性进行进一步验证。表达分析支持NPF主要作为脑和中肠来源信号分子发挥作用，而NPFR在触角中的高表达则提示其潜在参与嗅觉相关调节。功能实验则明确证明，该通路在黑绒鳃金龟中正向调控摄食，且与糖原代谢和繁殖力密切相关。讨论中同时指出，RNAi导致的糖原下降既可能源于摄食减少造成的外源碳水化合物供应不足，也可能反映NPF信号对糖原合成与分解途径存在直接调控作用。对于繁殖效应，作者认为产卵下降可能与摄食受限和能量供应不足共同有关。总体而言，研究确认了NPF/NPFR信号系统在该鞘翅目害虫中的核心调控作用，并为靶向该通路开发绿色防控策略提供了理论依据。
研究结论部分可译为：综上，在黑绒鳃金龟成虫中，NPF和NPFR主要分布于脑和中肠，而NPFR在触角中也呈高丰度表达。NPF–NPFR信号通路参与摄食行为、能量代谢和繁殖的调控。这些发现推进了对该信号系统在鞘翅目昆虫中生理功能的认识，并为开发防控黑绒鳃金龟的新型生态友好型策略奠定了基础。然而，NPF–NPFR信号系统调控摄食、能量代谢和繁殖的精确分子机制仍有待进一步阐明。
