基于质谱(MS)的短链脂肪酸(SCFA)在不同样本中分析方法的发展及其在微生物组研究中的应用

《Agronomy》：Development of Mass Spectrometry-Based SCFA Analysis Methods in Diverse Samples for Microbiome Research

　　

随着微生物组(microbiome)研究的深入，短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs)因其对宿主免疫调节、能量稳态及炎症控制的关键作用而成为重要的代谢标志物，准确量化不同生物基质中的SCFA日益重要。然而，适用于多种样本类型的可靠标准化SCFA检测方法仍较欠缺。为此，研究人员优化了两种SCFA定量分析方法——顶空(headspace)气相色谱-质谱(GC-MS)法与GC-MS/MS法，并应用于纯微生物培养液、低丰度动物肝脏、动物粪便及标准化模拟人粪样等多种生物基质。顶空GC-MS法无需复杂前处理即可直接分析，提高了通量；GC-MS/MS法则经甲醇提取、碱处理及N-叔丁基二甲基硅基(N-tert-butyldimethylsilyl, TBDMS)衍生化(以MTBSTFA为衍生化试剂)，具备更高灵敏度与精密度，适用于低体积、低丰度样本。两种优化方案为跨基质SCFA谱图分析提供了稳健平台，有助于深入理解微生物组-宿主互作及转化应用。

论文解读：基于质谱的短链脂肪酸(SCFA)多样本分析方法开发及其在微生物组研究中的应用

本文发表于《Life》(MDPI)，研究针对微生物组相关生物样本中短链脂肪酸(short-chain fatty acids, SCFAs；主要指乙酸C2、丙酸C3、丁酸C4、戊酸C5)缺乏可靠标准化定量方法的现状展开。SCFA由肠道微生物发酵膳食纤维产生，是菌群-宿主互作的关键介质，参与结肠细胞供能、肠道屏障维持、免疫调节及代谢稳态，其浓度异常与肥胖、糖尿病、炎症性肠病等相关。目前气相色谱(gas chromatography, GC)及GC-质谱(mass spectrometry, MS)虽常用于SCFA检测，但存在样品前处理中SCFA易损失、回收率偏低、基质干扰大、通量低及低丰度样本检测灵敏度不足等问题，且缺少适用于从简单培养液到复杂粪便、组织等多基质的通用的对比评估方案，因此有必要建立互补的快速与高灵敏度检测方法并明确其适用范围。

研究人员通过优化顶空(headspace, HS) GC-MS（无衍生化、直接进样）与衍生化结合的三重四极杆GC-MS/MS（GC-MS/MS, triple quadrupole mass spectrometer in multiple reaction monitoring, MRM mode）两种互补方法，在纯菌液(Lacticaseibacillus rhamnosus, Pediococcus acidilactici, Ruminococcus bromii, Rutibacterium gallinarum)、C57BL/6J小鼠肝脏（对照组、STZ诱导糖尿病组、丁酸处理组、益生菌处理组）、BALB/c小鼠粪便（肺炎克雷伯菌感染动态采集）及SHIME^?模拟人结肠粪样四种代表性基质中进行方法学验证与应用测试，明确了两种方法各自的灵敏度(limit of detection, LOD)、线性、加标回收率及基质适用性，提出了基于样本体积、浓度、纯度选择分析策略的决策框架。

主要关键技术方法：

研究人员建立并比对两种SCFA定量技术：①顶空GC-MS法——样品加NaCl与稀H₂SO₄密封于顶空瓶，90℃平衡后取顶空气体进样，Elite-FFAP柱分离，电子轰击电离(electron ionization, EI)，选择离子监测(selected ion monitoring, SIM)模式定量；②GC-MS/MS法——样品用甲醇+稀NaOH沉淀蛋白，-20℃冷沉离心取上清真空干燥，先后经甲氧胺盐酸盐(methoxyamine hydrochloride, MeOX)于60℃孵育及N-甲基-N-(叔丁基二甲基硅基)三氟乙酰胺(N-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide, MTBSTFA)硅烷化衍生化，DB-5MS柱分离，三重四极杆MRM模式检测。两种方法均用系列浓度标准曲线定量，并以空白-标准-样品顺序自动进样以减少残留。样本来源包括纯微生物培养上清、小鼠肝组织、小鼠粪便及SHIME模拟人粪样。

3. Results（结果）

3.1. Results of Method Validation for Quantitative Analysis of SCFAs Using Headspace GC-MS

顶空GC-MS各SCFA校准曲线R²达0.995150–0.997167，显示良好线性；LOD约为1 μg/mL（乙酸、丙酸在低浓度信号偏弱）；加标回收率乙酸为102.96%–103.53%，丙酸、丁酸、戊酸为95.46%–138.83%；特征碎片离子SIM模式下乙酸m/z 43/45，丙酸m/z 45/74，丁酸与戊酸m/z 60/73，保留时间重现性好。表明该法适合较高浓度、相对纯净样品快速定量。

3.2. Optimization of MRM-Based Quantitative Analysis of SCFAs Using GC-MS/MS

GC-MS/MS各SCFA校准曲线R²> 0.995，LOD低至1 ng/mL，较顶空法灵敏约1000倍；优化得到各SCFA最佳MRM离子对及碰撞能(collision energy, CE)：乙酸117→75(CE 9 V)/118→76(CE 6 V)/117→71(CE 12 V)；丙酸131→75(CE 21 V)/131→112(CE 6 V)/131→83(CE 6 V)；丁酸145→140(CE 27 V)/145→75(CE 3 V)/145→93(CE 6 V)；戊酸147→73(CE 15 V)/189→147(CE 3 V)/148→60(CE 36 V)。保留时间分别为乙酸4.398 min、丙酸5.598 min、丁酸6.948 min、戊酸7.248 min，分离良好。

3.3. Application of Quantification Strategy According to Sample Type

比较显示：稀释至1 ng/mL的培养液顶空法无法检出峰而GC-MS/MS可清晰识别；未稀释复杂培养基顶空受杂质峰干扰而GC-MS/MS选择性好；GC-MS/MS在>200 μg/mL出现信号饱和，理想定量范围<100 μg/mL；模拟人粪样中GC-MS/MS可选择性检测SCFA而顶空受大量干扰峰影响。结论为顶空GC-MS适合大体积、高浓度、低杂质样本（如培养液）；GC-MS/MS适合小体积、低丰度及复杂基质（肝、粪便等）。

3.4. Evaluation of SCFA Quantification in Culture Media Samples Using the Headspace Method

对L. rhamnosus及两株Pediococcus acidilactici培养上清进行顶空GC-MS定量，均可检出乙酸、丁酸、戊酸（丙酸未检出或低于定量限），浓度结果与菌株产酸特征相符，证明顶空法在菌液SCFA定量中的可靠性与重复性。

3.5. SCFA Quantification in Microbiome-Associated Samples Using GC-MS/MS

GC-MS/MS成功定量四类样本SCFA：纯菌培养液中检出乙酸(~152–173 μg/mL)、丙酸(~53–60 μg/mL)、微量丁酸(~1.3–1.5 μg/mL)及戊酸(97–160 μg/mL)；小鼠肝组织中乙酸、丙酸、丁酸、戊酸在不同干预组间呈现差异（如STZ组乙酸升高、丁酸处理组丁酸升高）；感染小鼠不同天数粪便中SCFA随时间波动；SHIME模拟人粪样中四种SCFA随培养阶段升高并在稳定期维持较高水平，证明GC-MS/MS在低丰度组织及复杂粪样中的稳健定量能力。

讨论与结论总结：

讨论部分指出，溶剂选择因方法而异——顶空分析用水可提高顶空气相分配稳定性，GC-MS/MS用甲醇因极性匹配及易挥干利于衍生化；MTBSTFA生成热稳定、耐水的叔丁基二甲基硅基(TBDMS)衍生物，配合MeOX肟化可减少副反应，共同提升GC-MS/MS灵敏度与抗干扰能力。通过多基质对比验证，明确顶空GC-MS具操作简便、无衍生化、高通量优点，但灵敏度较低(LOD ~1 μg/mL)且易受共流出挥发物干扰；GC-MS/MS经提取-衍生化-MRM检测具高灵敏度(LOD ~1 ng/mL)、高选择性，适合小体积及复杂基质，但前处理较繁琐。研究者提出依据样本体积、浓度、纯度选取方法的决策表：大体积高浓低杂用顶空；小体积、低丰度或任何低纯度（复杂）样本优先用GC-MS/MS。

结论部分翻译如下：

总之，本研究证明顶空分析与GC-MS/MS是在多样化生物标本中对短链脂肪酸(SCFA)进行定性与定量分析的互补方法。本研究建立的分析框架为根据样本类型、基质复杂度、分析物浓度及样本量选择合适SCFA定量方法提供了实用指导。该策略可支持未来临床微生物组研究与靶向代谢组学，实现对粪便及低丰度组织等复杂生物样本中SCFA的可靠分析，并可协助发现潜在生物标志物及阐明微生物组相关疾病与治疗效应。顶空分析适于快速筛查，GC-MS/MS可实现精准定量，二者均为人体代谢与肠道菌群研究的重要工具。未来需进一步提升顶空法灵敏度并简化GC-MS/MS流程以提高通量，拓展其在生理与临床研究中的应用价值。