种植窗期子宫内膜微生态菌群(microbiome)组成与局部免疫细胞分布之间的关联

《Immuno》：Association Between Endometrial Microbiome Composition and Local Immune Cell Distribution During the Window of Implantation

　　

摘要：本研究旨在探讨种植窗期(implantation window, 即月经周期中 secretory中期，排卵后第5天)子宫内膜微生态菌群(endometrial microbiome)与局部免疫细胞组成之间的关联。研究人员开展了一项单中心前瞻性观察性研究，纳入58例无子宫内膜病变女性的子宫内膜标本。所有标本于分泌中期(排卵后第5天)获取。采用免疫组织化学法鉴定基质中CD3+T细胞、CD4+T辅助细胞(helper T cells, Th)、CD56+自然杀伤(natural killer, NK)细胞及CD68+巨噬细胞(macrophages, MΦ)，并使用HALO图像分析软件以基质细胞百分比进行定量。微生态菌群组成通过16S rRNA基因测序(V4–V5区)评估。乳杆菌优势(Lactobacillus dominance, LD)定义为各标本中居中对数比(centered log-ratio, CLR)值最高的菌属。子宫内膜免疫细胞组成的中位值为：基质细胞中CD3+T细胞占2.28%，CD56+NK细胞占1.75%，CD68+巨噬细胞占1.44%，CD4+T辅助细胞占0.29%。51.7%(30/58)的标本被鉴定为乳杆菌优势(LD)。相关性分析显示，乳杆菌相关类群与NK/T比值呈负相关，与T辅助细胞相关比值呈正相关。与非LD标本相比，LD标本的NK细胞丰度降低(1.17% vs. 2.12%, p = 0.006, q = 0.023)，NK/T比值亦降低(0.52 vs. 1.05, p = 0.004, q = 0.023)。本研究为种植窗期子宫内膜微生态菌群与局部免疫调节之间存在联系提供了证据。

论文解读：《Association Between Endometrial Microbiome Composition and Local Immune Cell Distribution During the Window of Implantation》（发表于Immuno）

一、研究背景与立项依据

子宫内膜是动态变化的组织，成功胚胎着床依赖于免疫、微生物及激素因素的精细平衡。既往被认为无菌的子宫内膜已被证实存在独特的子宫内膜微生态菌群(endometrial microbiome)，通常以乳杆菌属(Lactobacillus)为优势菌属，且乳杆菌优势与体外受精-胚胎移植(IVF)周期中成功的胚胎着床相关；反之非乳杆菌优势可能反映微生态失调(dysbiosis)及子宫内膜容受性(receptivity)下降。黏膜菌群可通过固有免疫与适应性免疫的复杂互作塑造宿主免疫反应，而在胚胎着床过程中，精细的免疫调节对胚胎接受及早期妊娠建立至关重要——特别是基质中各类免疫细胞的数量及比值（如Th/T、NK/T、MΦ/T、Th/MΦ）已被报道与种植成功密切相关，其中CD56⁺NK细胞增多常伴促炎与细胞毒表型，不利于种植所需的免疫耐受。然而，子宫内膜微生态菌群究竟如何调控局部免疫微环境进而影响子宫内膜容受性尚未明确，微生态菌群与局部免疫细胞组成间的具体关联仍缺乏直接证据。为此，研究人员开展此项研究，旨在明确种植窗期子宫内膜微生态菌群组成与局部免疫细胞丰度及功能相关比值间的关联，以揭示其潜在生物学机制。该研究最终发现乳杆菌优势微生态与较低的NK细胞丰度及较低的NK/T比值相关联，支持微生态菌群参与调控局部免疫平衡，对理解子宫内膜生物学及生殖医学具有一定意义。

二、主要关键技术方法概述

研究人员纳入单中心58例年龄<45岁、因非子宫内膜因素行未刺激辅助生殖技术(ART)周期女性，排除子宫内膜异位症、息肉、腺肌症、增生/癌及细菌感染者。于月经周期分泌中期（尿LH峰后第5天）在超声引导下用Pipelle吸取子宫内膜活检组织，一份4%中性甲醛固定、石蜡包埋供免疫组织化学，一份PBS轻洗后-80℃冻存供16S rRNA扩增子测序。免疫组织化学采用抗CD3、CD4、CD68、CD56抗体在自动染色仪上标记，HALO图像分析软件定量阳性细胞占基质细胞的百分比（排除腺上皮与腔上皮）。16S rRNA基因V4–V5区PCR扩增后Illumina MiSeq双端测序，设阴性对照监控污染；QIIME流程进行质控、嵌合体去除、97%相似度UPARSE聚类为操作分类单元(OTU)，基于SILVA数据库进行分类学注释，计算α多样性（Shannon指数、观测特征数、Pielou均匀度）与β多样性（Bray–Curtis相异度、unweighted UniFrac）。乳杆菌优势(LD)定义为标本内各菌属CLR变换后Lactobacillus具最高值者。统计学采用Mann–Whitney U检验、Spearman相关分析及Benjamini–Hochberg FDR校正(q<0.05为显著)。

三、研究结果

3.1. Baseline Characteristics of the Studied Patients

研究对象平均年龄36±4岁，LD组(35±5岁)与非LD组(36±8岁)年龄无显著差异(p>0.05)，组间基线可比。

3.2. Endometrial Immune Characteristics

所有待测免疫细胞群均于子宫内膜基质中被检出，腔上皮与腺上皮少见阳性故剔除。定量结果为：CD3⁺T细胞占基质细胞中位数2.28%[IQR 2.34]，CD4⁺T辅助细胞0.29%[0.62]，CD56⁺NK细胞1.75%[1.85]，CD68⁺巨噬细胞1.44%[1.58]；免疫细胞比值分别为NK/T中位数0.75[1.00]、Th/T 0.16[0.36]、MΦ/T 0.80[0.90]、Th/MΦ 0.23[0.51]。表明种植窗期人子宫内膜基质含少量但可定量的各类免疫细胞及特定比值分布。

3.3. Endometrial Metagenomic Profile

整体α多样性低（Shannon指数中位数0.99[IQR 1.13]），观测特征数中位数27.5[36.75]，Pielou均匀度低(0.18[0.25])，提示群落结构极不均匀。30例(51.7%)为乳杆菌优势(LD)，其余为非LD，非LD分别以Acinetobacter、Cupriavidus、未分类Muribaculaceae及其他多样菌属为优势。非LD组观测特征数(57.50[56.25] vs. 19.50[8.50], p<0.001)及Pielou均匀度(0.28[0.21] vs. 0.10[0.16], p=0.004)显著高于LD组，Shannon指数亦呈升高趋势(p=0.076)。基于Bray–Curtis的β多样性分析显示LD与非LD组微生物群落组成显著不同(PERMANOVA, pseudo-F=21.609, p=0.0010)。说明子宫内膜微生态分化为LD与非LD两种模式，非LD伴随更高微生物多样性。

3.4. Association Between Microbiome and Immune Composition

经FDR校正后，发现多个菌属与免疫参数显著相关：乳杆菌相关分类单元与NK/T比值呈稳定负相关；放线菌科(Actinomycetaceae)、奈瑟菌科(Neisseriaceae)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)及里氏菌科(Rikenellaceae)与CD4⁺T细胞相关比值（如Th/T）呈正相关。表明不同菌科与特定免疫细胞分布格局存在特异性关联。

3.5. Lactobacillus Dominance and Immune Composition

按LD分组比较免疫参数显示：LD组基质中CD56⁺NK细胞百分比显著低于非LD组(1.17%[1.44] vs. 2.12%[2.55], p=0.006, q=0.023)；LD组NK/T比值亦显著低于非LD组(0.52[0.91] vs. 1.05[1.10], p=0.004, q=0.023)。其余免疫细胞百分比及比值(CD3⁺T、CD4⁺Th、CD68⁺MΦ、Th/T、MΦ/T、Th/MΦ)两组间无显著差异。提示乳杆菌优势微生态与种植窗期较低NK细胞丰度及较低NK/T免疫表型共存，该表型既往被认为与较高容受性/免疫耐受相关。

四、讨论与结论总结（翻译结论部分）

讨论指出，本研究直接检测了种植窗期子宫内膜微生态与局部免疫细胞组成的关联：乳杆菌相关类群与低NK/T比值负相关，某些非乳杆菌菌科与高Th相关比值正相关；LD组NK细胞丰度及NK/T比值显著低于非LD组，符合先前报道的有利于胚胎接受的免疫耐受表型。由于为观察性设计，尚不能确立因果方向，免疫微环境反过来亦可影响微生态。局限性包括样本量偏小、无生育力正常对照、16S rRNA测序分类分辨率有限、免疫分析仅限表型未测功能与细胞因子、CD4染色无法区分Th1/Th2/Treg等亚群。未来需更大样本、更高分辨率微生态分析及功能免疫检测并结合临床结局进一步验证。

结论（翻译自原文Conclusions）：

本研究表明，月经周期分泌中期（种植窗期）子宫内膜微生态菌群(endometrial microbiome)组成与局部免疫细胞分布之间存在显著关联。乳杆菌优势(Lactobacillus-dominated)微生态与较低的CD56⁺NK细胞丰度及降低的NK/T比值相关联，符合既往认为具有免疫耐受(tolerogenic)特征的子宫内膜免疫表型。总体而言，这些发现支持种植窗期子宫内膜微生态菌群组成与局部免疫细胞组织结构间存在关联，增进了关于子宫内膜生物学中微生态–免疫互作的认识，并为未来探索其在生殖医学及子宫内膜诊断中的潜在价值奠定了基础。