昼夜节律对克氏原螯虾肠道微生物群和时钟基因表达的影响

《Clocks & Sleep》：Influences of Diurnal Rhythms on Gut Microbiota and Clock Gene Expression in Procambarus clarkii

　　

本研究调查了红沼泽螯虾（Procambarus clarkii）肠道微生物群和核心时钟基因表达的昼夜动态。在24 h内于四个时间点（06:00、12:00、18:00和24:00）收集样本。使用16S rRNA基因测序（16S rRNA gene sequencing）分析肠道微生物群特征，同时使用定量实时聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR）检测肝胰腺和眼柄中核心时钟基因的表达模式，包括Cycle (Cyc)、Clock (Clk)和隐花色素1型（cryptochrome type 1, Cry1）。结果表明，肠道微生物群的α-多样性指数（Shannon、Simpson、ACE、Chao1）的Kruskal–Wallis检验和β-多样性（Bray–Curtis）的PERMANOVA在四个时间点均未显示显著的昼夜变化（所有p > 0.05）。厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidota）是优势门，norank_o_RsaHf231、ZOR0006和拟杆菌属（Bacteroides）是优势属。尽管整体微生物结构保持稳定，但几个分类群，包括未分类的芽孢杆菌纲（unclassified_c_Bacilli）、未分类的柄杆菌科（unclassified_f_Caulobacteraceae）、Gemmobacter、未分类的红杆菌科（unclassified_f_Rhodobacteraceae）、Allorhizobium–Neorhizobium–Pararhizobium–Rhizobium、乳杆菌属（Lactobacillus）和未分类的弧菌科（unclassified_f_Vibrionaceae）表现出时间依赖性波动。此外，肝胰腺和眼柄中Cyc、Clk和Cry1的相对mRNA表达水平显示出显著的昼夜变化。本研究揭示了P. clarkii肠道微生物群和核心时钟基因表达的昼夜动态特征，为进一步研究昼夜调节机制和生理适应提供了基础。

昼夜节律（circadian rhythms）是生物体内约24小时周期的内源性生物振荡，使生理过程与昼夜环境周期同步，在水生动物中调控免疫、代谢、生长和发育等关键过程。光周期作为重要环境驱动因素，可影响宿主肠道微生物群（gut microbiota）的动态结构；而肠道微生物群在宿主消化、能量吸收、免疫调节和疾病易感性中发挥核心作用。克氏原螯虾（Procambarus clarkii）作为重要水产养殖物种，其强适应性、高繁殖力、短生长周期和高市场价值使其养殖效益显著，但昼夜节律对其肠道微生物群和节律相关基因表达的影响尚不清楚。为此，研究人员开展了本研究，相关论文发表在《Clocks》期刊上。

研究人员采用了以下关键技术方法：样本于2024年8月采集自中国湖北潜江和江苏金湖的养殖场，在沈阳农业大学实验室适应性驯化14天（光周期12L:12D，温度20±0.5°C，每日两次投喂）。肠道微生物群通过16S rRNA基因测序（V3-V4高变区，引物338F/806R，Illumina Nextseq 2000测序）分析，并使用QIIME2进行扩增子序列变体（ASV）鉴定和分类分配。核心时钟基因Cyc、Clk和Cry1在肝胰腺和眼柄中的mRNA表达通过定量实时聚合酶链反应（qPCR，2^-??Ct法）检测，以β-actin为内参。采样时间点为ZT6（06:00）、ZT12（12:00）、ZT18（18:00）和ZT24（24:00），每个时间点6个生物学重复。

研究结果如下：

**肠道细菌测序概述**：通过测序获得1,292,661条高质量序列，平均长度425 bp，共鉴定出2825个ASV（包括20个门、374个属、503个种）。Venn图显示四个时间点间仅有91个共享ASV，各时间点存在大量特异性ASV（ZT6:464、ZT12:552、ZT18:745、ZT24:696）。

**肠道细菌群落结构的昼夜变化**：α-多样性指数（Shannon、Simpson、ACE、Chao1）经Kruskal–Wallis检验在四个时间点间无显著差异（所有p>0.05）。基于Bray–Curtis距离的β-多样性分析（PCoA和NMDS）及PERMANOVA检验也显示群落结构无显著分离，表明整体微生物组在昼夜周期中保持稳定。

**肠道细菌分类丰度的昼夜变化**：优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidota）和放线菌门（Actinobacteriota）；优势属包括norank_o_RsaHf231、ZOR0006、拟杆菌属（Bacteroides）、Shewanella和未分类的肠杆菌科（Enterobacteriaceae）。LEfSe分析（LDA>2.0）鉴定出21个差异分类群，其中乳杆菌属（Lactobacillus）、Dyadobacter和弧菌科成员在06:00显著富集；γ-变形菌纲在12:00丰度较高；α-变形菌纲、红杆菌目成员和芽孢杆菌纲在18:00富集；Gemmobacter、Pheatobacter和Allorhizobium–Neorhizobium–Pararhizobium–Rhizobium在24:00丰度最高。属水平比较显示，未分类的芽孢杆菌纲、未分类的柄杆菌科和未分类的红杆菌科在18:00达到峰值；Allorhizobium–Neorhizobium–Pararhizobium–Rhizobium和Gemmobacter从18:00开始上升，在24:00达峰；而乳杆菌属和未分类的弧菌科在06:00达峰。

**核心时钟基因的mRNA表达**：肝胰腺和眼柄中Cyc、Clk和Cry1的相对mRNA表达均呈现出显著的时间依赖性波动。在眼柄中，Cyc和Clk在18:00表达最高，但Cyc在其他时间点保持稳定，而Clk在06:00最低；Cry1在眼柄中于06:00达峰，其他时间点无显著变化。在肝胰腺中，Cyc和Cry1在06:00和24:00低表达，12:00上升，18:00达峰值；Clk也在18:00达到最高表达，其他时间点一致。

**肠道微生物群与时钟基因的相关性分析**：对前30个细菌属与6个时钟基因表达进行Spearman相关分析发现，未分类的红杆菌科、Exiguobacterium、Gemmobacter和Glutamicibacter的丰度与眼柄中Cry1表达呈显著负相关，与眼柄中Clk表达呈显著正相关；眼柄中Cry1表达与Erysipelatoclostridium丰度呈显著正相关；肝胰腺中Cyc表达与未分类的红杆菌科丰度呈显著正相关。

讨论部分指出：整体微生物结构稳定可能与恒定温度（20±0.5°C）减少了昼夜温度波动对菌群的影响有关，这与先前研究中温度未严格控制的实验结果不同。优势菌门的功能与碳水化合物发酵、能量代谢、植物多糖降解及免疫功能相关。与部分研究相比，本研究中柔壁菌门（Tenericutes）丰度极低，可能由于采样前24小时禁食处理所致。时间依赖性波动的菌属（如芽孢杆菌纲和乳杆菌属）的丰度变化与摄食活动和光暗周期同步，表明摄食和光周期共同驱动了特定菌群的昼夜动态。核心时钟基因表达的昼夜波动与肠道微生物群的时间变化相关联，相关分析提示特定菌属可能与宿主昼夜节律机制存在功能联系，但禁食条件下这些波动也可能反映宿主源性内源性分泌物的被动响应。组织特异性表达模式（如眼柄中Cry1在06:00达峰，肝胰腺中在18:00达峰）可能与眼柄（神经内分泌中枢）和肝胰腺（消化代谢器官）的不同生理功能有关。

研究结论：研究人员的发现表明，克氏原螯虾（P. clarkii）在24小时内宿主核心时钟基因表达和特定微生物分类群表现出昼夜动态。整体肠道微生物结构相对稳定，但功能群（如芽孢杆菌纲和乳杆菌属）的时间依赖性波动可能与宿主摄食活动和光暗周期有关。然而，由于24小时禁食条件，这些波动也可能反映对节律性宿主源性内源性分泌物的被动反应，而非细菌自身的内源性节律。时钟基因表达与消化微生物群在18:00的同步为优化投喂策略提供了潜在基础，提示在18:00（峰值代谢活性时间）进行投喂可能提高效率，但这需要受控试验验证。总体而言，这些发现为发展克氏原螯虾养殖的时间生物学方法提供了初步科学框架，但需进一步通过解耦光周期和摄食计划的研究来确认潜在机制。