生物打印的人体皮肤等效物用于评估非侵入性单极射频治疗：一种新方法

《Lasers in Medical Science》：Bioprinted human skin equivalent for evaluating non-invasive monopolar radiofrequency treatment: a novel approach

　　

为建立标准化的3D人体真皮模型以评估非侵入性单极射频（NMRF）治疗的生物学和力学效应，研究人员通过生物打印技术制备了含有人真皮成纤维细胞的胶原基3D真皮构建物，并施以NMRF处理。采用组织学、免疫荧光、扫描电子显微镜（SEM）和压缩测试评估组织重塑。将处理构建物的条件培养基分别施加于成纤维细胞、黑色素细胞和角质形成细胞，评估其对迁移、色素沉着和氧化应激的旁分泌效应。NMRF处理导致成纤维细胞活性增强和细胞体积增大，同时形成更致密、更有序的胶原网络，组织学与SEM分析证实了这一点。免疫荧光染色显示活化成纤维细胞周围I型胶原沉积显著增加。生物力学测试显示压缩模量显著升高、组织尺寸减小，表明真皮硬度与基质重塑增强。此外，来自NMRF处理构建物的条件培养基在伤口愈合实验中显著促进成纤维细胞迁移，抑制α-黑色素细胞刺激激素（α-MSH）刺激的B16F10黑色素瘤细胞中黑色素生成相关基因（MITF、酪氨酸酶、Trp-1、Trp-2）的表达，并提高暴露于氧化应激（H₂O₂）的角质形成细胞的存活率。该3D真皮模型能够可重复地评估NMRF诱导的真皮重塑。NMRF改善真皮结构并调节旁分泌信号，表明其在皮肤紧致、色素沉着控制和组织再生方面具有治疗潜力。

**研究背景与意义**
皮肤作为人体与环境的第一道屏障，承担保护、体温调节、免疫防御和稳态维持等关键功能。真皮是皮肤的结构基础，主要由成纤维细胞和富含胶原的细胞外基质（ECM）构成。内在衰老和外界应激导致成纤维细胞功能障碍，表现为胶原产量下降、真皮萎缩和皮肤松弛加剧。为恢复胶原稳态和改善皮肤生物力学性能，非侵入性单极射频（NMRF）技术应运而生。NMRF通过输送可控电磁能量，诱导真皮容积加热，激活成纤维细胞并促进新生胶原合成。临床研究表明其可改善皮肤弹性和减少皱纹，但确切机制尚不明确。当前评估NMRF疗效的主要障碍是缺乏标准化体外模型。传统研究依赖在体实验，受个体差异、伦理限制和技术条件制约，难以实时监测组织反应。为此，研究人员引入一种三维（3D）生物工程真皮组织模型作为可重复平台，通过生物打印技术构建胶原基3D结构，以系统研究NMRF的生物学和力学效应。该研究建立了标准化的体外真皮模型，为阐明NMRF介导皮肤年轻化的机制提供了新工具，论文发表在《Lasers in Medical Science》。

**主要关键技术方法**
研究采用微挤出生物打印技术，将含有人新生儿真皮成纤维细胞（NHDF，来源：Gibco）的0.6%医用级I型胶原生物墨水（Dalim Tissen, 韩国）直接打印至带有3.0 μm孔径聚碳酸酯膜的定制组织培养插件（Corning）中，经交联和培养后形成3D真皮构建物。使用XERF单极射频设备（Cynosure Lutronic Inc., 韩国）以Deep模式、能量水平5、单次照射（＜2 s）施加NMRF处理，利用红外热成像监测表面温度。处理后通过组织学、免疫荧光、扫描电子显微镜（SEM）和旋转流变仪压缩测试评估结构重塑；收集条件培养基（CM）分别应用于人皮肤成纤维细胞（Hs68）、B16F10黑色素瘤细胞和HaCaT角质形成细胞（来源：韩国浦项科技大学K.T. Kim和J. Lee博士），通过划痕实验、qRT-PCR和AlamarBlue检测评估旁分泌效应。

**研究结果**
**1. 用于NMRF评估的3D真皮模型的开发与验证**
通过红外热成像证实NMRF处理时构建物表面温度可控升高，表明能量有效传递至真皮模型。

**2. NMRF处理真皮模型的组织学与超微结构分析**
苏木精-伊红（H&E）染色显示NMRF处理后真皮构建物中成纤维细胞密度增加；SEM观察到胶原沉积增强、成纤维细胞体积增大，提示代谢活性和ECM重塑增强。免疫荧光染色显示NMRF处理后成纤维细胞周围新合成的I型胶原（COL1）显著增多，量化分析表明含新生胶原的细胞比例升高（Mann-Whitney U检验，p < 0.0001），支持NMRF促进胶原生物合成和真皮重塑。

**3. NMRF处理3D真皮模型的生物力学评估**
压缩测试显示NMRF处理组的压缩模量显著高于未处理组，反映组织刚度和结构完整性增强；同时组织面积和厚度均减小，表明成纤维细胞激活诱导组织收缩。

**4. NMRF处理真皮构建物对皮肤细胞的旁分泌效应**
划痕实验表明，NMRF处理构建物来源的条件培养基显著促进成纤维细胞（Hs68）迁移；α-MSH刺激的B16F10黑色素瘤细胞经该条件培养基处理后，细胞团变白，黑色素生成标志物MITF、酪氨酸酶、Trp-1和Trp-2的mRNA表达显著下调；氧化应激（H₂O₂）条件下的HaCaT角质形成细胞存活率提高，提示NMRF诱导的旁分泌因子具有抗黑色素生成和抗氧化损伤保护作用。

**总结讨论与结论**
本研究建立了新型体外3D真皮模型，专门用于评估NMRF的生物学效应。生物打印技术确保样本的可重复性和精确控制，克服了传统手动制备中水凝胶黏度不均和半月板所致的样本偏差。NMRF处理显著增强真皮重塑，表现为成纤维细胞活性提高、胶原密度增加、压缩模量上升及组织收缩，但SEM显示单根胶原纤维厚度未显著改变，可能与模型中缺失调节性基质成分（如富含亮氨酸的小分子蛋白聚糖和次要胶原）以及2周观察期不足有关。此外，NMRF修饰了真皮分泌组，条件培养基可促进成纤维细胞迁移、抑制黑色素生成、保护角质形成细胞免受氧化应激，提示NMRF在伤口愈合、色素调节和抗氧化方面具有附加潜力。研究者指出，本模型为不含表皮的纯真皮模型，可避免表皮分层变异对标准化的干扰，但缺乏血管网络是当前生物打印皮肤模型的共同局限，可能影响热消散与代谢模拟。结论部分总结：该3D真皮模型能够可重复地评估NMRF诱导的真皮重塑；NMRF改善真皮结构并调节旁分泌信号，表明其在皮肤紧致、色素沉着控制和组织再生方面具有治疗潜力。未来研究应纳入含血管、角质形成细胞和黑色素细胞的共培养系统，以更真实模拟皮肤微环境。