SARM1缺失改善常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调Charlevoix-Saguenay小鼠模型的表型

《Neurology Genetics》：Loss of SARM1 Improves Phenotypes in a Mouse Model of Autosomal Recessive Spastic Ataxia of Charlevoix-Saguenay

　　

背景与目的常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调Charlevoix-Saguenay（ARSACS）是一种由SACS致病性变异引起的神经退行性疾病。ARSACS的特征在于线粒体异常和神经丝细胞骨架的破坏。在其他情况下，这些特征与无菌α和TIR基序蛋白1（SARM1）的激活有关，SARM1是一种可触发轴突变性和神经元死亡的酶。抑制SARM1是一种有吸引力的治疗策略，因为SARM1在健康细胞中无活性，且SARM1的敲除几乎没有或没有有害影响。因此，研究人员探究SARM1活性是否导致了Sacs^?/?小鼠模型（ARSACS的模型）中的浦肯野细胞变性和运动缺陷。方法研究人员研究了4组小鼠：（1）Sacs^?/?；Sarm1^+/+；（2）Sacs^+/+；Sarm1^+/?；（3）Sacs^?/?；Sarm1^+/?；（4）Sacs^?/?；Sarm1^?/?。在9个月大的小鼠中，研究人员分析了浦肯野细胞的蛋白质标志物（每种基因型n=3–4只小鼠），并计数了小脑切片中叶III、IV和VIII中存活的浦肯野细胞（每种基因型n=3只小鼠，每只小鼠6个切片），并通过量化步态参数（Digigait）以及协调性和平衡性参数（Rotarod）在3、6和9个月时测试运动功能（每种基因型8只雄性、8只雌性小鼠）。结果小脑提取物的免疫印迹显示，浦肯野细胞蛋白标志物Calbindin-1、RGS8和PCP2在Sacs^?/?小鼠中减少，但在Sacs^?/?；Sarm1^?/?小鼠中恢复至正常水平。如前所述，Sacs^?/?小鼠中浦肯野细胞的丢失在前部小叶中最显著。Sarm1缺失部分减轻了9个月大的Sacs^?/?小鼠中叶III的浦肯野细胞死亡。类似地，运动功能的纵向行为评估显示，步态模式（较慢的步频、延长的摆动期和站立期）的紊乱得到部分缓解。Rotarod测试给出了更模棱两可的结果，因为Sarm1的纯合缺失在改善Sacs^?/?表型方面不如杂合缺失有效。讨论研究人员得出结论，SARM1在ARSACS的神经变性中起作用，其下调或抑制可能构成该疾病治疗中的重要治疗策略。

**论文解读：SARM1缺失改善ARSACS小鼠模型中的神经退行性表型**

**研究背景与问题**

常染色体隐性遗传性痉挛性共济失调Charlevoix-Saguenay（ARSACS）是一种常见的遗传性共济失调，由SACS基因的致病性变异引起，导致Sacsin蛋白功能丧失。该疾病特征为小脑前部进行性退化、浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）死亡，并伴有线粒体形态异常和神经丝细胞骨架破坏。在更广泛的神经退行性研究领域，无菌α和TIR基序蛋白1（Sterile Alpha and TIR Motif Containing 1, SARM1）作为一种NADase（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸酶），其激活可耗竭NAD⁺并引发轴突变性和神经元死亡，已与周围神经病、青光眼和创伤性脑损伤等疾病相关。由于细胞骨架破坏和线粒体功能障碍均可激活SARM1，而这两者正是ARSACS病理学的特征，研究人员因此提出假设：SARM1的激活可能参与ARSACS的神经退行性机制。为验证这一假设，研究人员在Sacs^?/?小鼠（ARSACS模型）背景下引入Sarm1基因敲除，探究SARM1缺失是否能改善表型。

**研究方法与技术**

为实现研究目标，研究人员采用以下关键方法：
1. **小鼠品系与基因型构建**：使用Sacs敲除小鼠（由Roxanne Larivière博士提供）和Sarm1敲除小鼠（C57BL/6J背景，购自Jackson Laboratory），通过杂交获得4种基因型队列：（1）对照Sacs^+/+；Sarm1^+/?，（2）ARSACS模型Sacs^?/?；Sarm1^+/+，（3）Sarm1杂合缺失Sacs^?/?；Sarm1^+/?，（4）Sarm1纯合缺失Sacs^?/?；Sarm1^?/?。
2. **蛋白质表达分析**：提取9月龄小鼠小脑蛋白，通过Western blot检测浦肯野细胞标志物Calbindin-1（CALB1）、RGS8（G蛋白信号转导调节因子8）、PCP2（浦肯野细胞蛋白2）以及胶质纤维酸性蛋白（GFAP），并以β-肌动蛋白（ACTB）或甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参。
3. **免疫组织化学**：对9月龄小鼠进行心脏灌注固定，制备40μm矢状小脑切片，使用抗Calbindin-1抗体和Hoechst 33342染核，共聚焦显微镜成像并计数浦肯野细胞体。另用抗Calbindin-1和抗肌醇三磷酸受体1（IP3R1）抗体共染观察树突形态。
4. **行为学测试**：在3、6、9月龄进行纵向测试，包括Digigait步态分析（记录步频、摆动期、站立期等参数）和Rotarod转棒实验（评估运动协调与平衡，加速模式5–40 RPM）。

**研究结果**

**1. SARM1体内减少使Sacs^?/?小鼠的浦肯野细胞标志物水平正常化**
通过Western blot分析9月龄小鼠小脑提取物，发现Sacs^?/?；Sarm1^+/+小鼠的CALB1、RGS8和PCP2水平显著降低，而Sarm1杂合或纯合缺失（Sacs^?/?；Sarm1^+/?和Sacs^?/?；Sarm1^?/?）可恢复这些标志物至对照组水平。此外，GFAP（反映胶质增生）仅在Sacs^?/?；Sarm1^+/+小鼠中升高，Sarm1缺失后恢复正常。

**2. SARM1缺失部分阻止浦肯野细胞退化**
免疫组化定量显示，在9月龄Sacs^?/?；Sarm1^+/+小鼠中，前部小叶III和IV的浦肯野细胞显著丢失，而小叶VIII丢失较少。Sarm1纯合缺失（Sacs^?/?；Sarm1^?/?）可显著保护小叶III中的浦肯野细胞体，但对小叶IV和VIII效果不显著。树突染色（Calbindin-1和IP3R1共染）表明，Sarm1纯合缺失部分缓解了分子层中树突的减少。

**3. SARM1抑制缓解ARSACS小鼠的步态紊乱**
纵向步态分析显示，Sacs^?/?；Sarm1^+/+小鼠步频降低、摆动期和站立期延长。Sarm1杂合或纯合缺失均可显著增加步频、缩短摆动期和站立期，且效果在3月龄时最为明显。混合效应线性回归模型表明，每个Sarm1等位基因缺失使站立期缩短0.011秒，摆动期缩短0.014秒。但步态参数的改善在9月龄时变得部分且较轻微。

**4. SARM1缺失对转棒测试的影响**
在Rotarod测试中，Sacs^?/?；Sarm1^+/+小鼠表现明显差于对照组（Sacs^+/+；Sarm1^+/?）。然而，Sarm1纯合缺失未能改善该缺陷，而Sarm1杂合缺失在3月龄时表现出部分改善作用。性别分析显示雌雄小鼠下降速率相似，且Sarm1缺失效应无性别差异。

**讨论与结论**

讨论部分指出，SARM1正被视为神经退行性疾病中一个有吸引力的治疗靶点，因其NADase活性在健康细胞中失活，且Sarm1^?/?小鼠健康，抑制SARM1可能副作用较少。本研究在Sacs^?/?小鼠中结合生化、免疫组化和行为学证据，有力支持SARM1参与ARSACS病程进展。然而，Sarm1缺失未能长期保护运动共济失调，提示SARM1并非唯一驱动因素，可能仅介导早期快速触发机制，而与其他缓慢退化路径并行。研究中Sarm1杂合缺失在蛋白标志物恢复和行为改善上有时优于纯合缺失，表明部分抑制即可能获益。研究结论为：SARM1在ARSACS的神经变性中发挥作用，其下调或抑制可能构成该疾病重要的治疗策略。此外，研究讨论了可能的治疗途径，如小分子抑制剂、反义寡核苷酸（ASO）及显性负性SARM1表达，提示SARM1抑制值得作为延缓疾病进展的潜在方法，并作为未来ARSACS治疗的组成部分。