窖泥（pit mud）对酒醅（Jiupei）细菌群落及挥发性代谢物空间异质性的影响：基于挥发性代谢组学（volatile metabolomics）与微生物群落分析的见解

《Journal of Agriculture and Food Research》：Effects of pit mud on the spatial heterogeneity of bacterial communities and volatile metabolites in Jiupei: Insights from volatile metabolomics and microbial community analysis

　　

发酵窖池内微生物群落与代谢物的空间异质性对浓香型白酒（NX-Baijiu）品质具有决定性作用，但目前对此理解仍不充分。为解决这一问题，研究人员通过对比新窖与老窖中的窖泥（PM）与酒醅（JP），系统表征了浓香型白酒发酵系统中微生物群落及其代谢功能的空间动态。样本采自1年窖龄与10年窖龄窖池的多个垂直与水平位置，系统分析了理化性质、有机酸、挥发性有机化合物（VOC）及细菌群落。结果表明，窖龄对理化性质与微生物组成的影响强于空间位置。老窖泥表现出更高的营养水平、更大的微生物多样性及更明显的空间异质性。酒醅中存在清晰的空间梯度，微生物多样性、有机酸及挥发性有机化合物随距窖泥距离的变化而变异。值得注意的是，耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）与金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillus jinshanensis）在酒醅中占优势，并沿窖泥距离梯度呈相反的分布趋势。挥发性有机化合物分析显示酯类是所有样本中的主导化合物，而酸类在老窖中贡献更显著。偏最小二乘路径模型（PLS-PM）分析表明，酒醅中挥发性有机化合物的空间分布可能与窖泥理化性质及微生物群落结构有关。综上，该研究提示窖泥与酒醅中微生物群落及代谢物空间异质性相关联，最终塑造了浓香型白酒的风味形成。这些发现为白酒发酵的微生态模式与潜在机制提供了新见解，并为通过靶向调控窖池环境以提升产品质量奠定了理论基础。

该研究发表于《Journal of Agriculture and Food Research》。研究背景方面，中国白酒是世界最古老且最复杂的传统蒸馏酒之一，其中浓香型白酒（NX-Baijiu）为市场主导香型，其独特感官特征来自地下窖池固态发酵，窖池衬以窖泥（pit mud, PM），发酵基质为酒醅（Jiupei, JP）。发酵微生物群系尤其是窖泥与酒醅中的微生物对特征风味化合物的产生至关重要：酒醅优势类群（如酵母属Saccharomyces、乳杆菌属Lactobacillus）执行糖化并将糖转化为乙醇与有机酸（如乳酸、乙酸），而窖泥常驻微生物（如梭菌属Clostridium、产己酸菌属Caproiciproducens）将这些中间产物转化为风味前体（丁酸、己酸），再酯化为定义浓香型白酒核心香气的乙酯类。既往研究多关注理化参数、发酵轮次、工艺技术、封窖方式等，常把窖池视为均一实体，忽视了发酵系统内微生物群落与代谢物的空间异质性。实证观察表明原酒质量在同一窖池内随垂直深度及距窖泥水平距离存在显著变异，这种空间变异制约了高质量稳定白酒的生产；窖泥微生物群落在窖龄与位置上存在动态时空变化，部分微生物在发酵期从窖泥迁移进入酒醅，可能影响酒醅中风味化合物的空间分布。因此研究人员假设窖泥微生物群系的空间异质性可能影响酒醅微生物群落，导致不同空间位置与窖龄下风味化合物形成差异。研究人员以发酵结束后的新窖（1年窖龄）与老窖（10年窖龄）为对象，采集不同垂直层（顶、中、下、底）与水平位置（酒醅层中距窖泥由近及远JPA、JPB、JPC、JPD、JPE，JPA邻窖泥，JPE在酒醅层中点最远）的样本，每个空间位置样本来自5个独立同窖龄窖池作为生物学重复；系统测定窖泥与酒醅的理化性质（水分、pH、总酸（TA）、腐殖质（HU）、氨态氮（AN）、有效磷（APH）、有效钾（APO））、4种主要有机酸（乙酸（AA）、乳酸（LA）、丁酸（BA）、己酸（CA））与乙醇（HPLC定量）、挥发性有机化合物（VOC，采用顶空固相微萃取气相色谱质谱HS-SPME GC-MS半定量分析）、细菌群落（基于全长16S rRNA基因PacBio Sequel II平台高通量测序）；运用统计方法包括非度量多维尺度分析（NMDS）基于Bray-Curtis距离、置换多元方差分析（PERMANOVA）、修正随机率（MST）量化随机与确定性过程贡献、线性判别分析效应大小（LEfSe，LDA>2）识别差异类群、（正交）偏最小二乘判别分析（(O)PLS-DA）与变量投影重要性（VIP>1，｜log₂(Fold Change)｜>1）筛选差异VOC、Mantel检验分析VOC与微生物群落关系、冗余分析（RDA）探索微生物与理化参数关联、偏最小二乘路径模型（PLS-PM）评估窖泥理化性质、微生物群落组成与多样性对酒醅VOC谱的影响。研究得出如下结果。3.1 理化参数差异：老窖泥各空间位置的含水量、AN、APH、APO、HU均显著高于新窖泥（p<0.01），老窖泥理化性质空间异质性更明显，呈单峰分布（峰在中层或下中层）；新窖泥则自上而下水分、pH、AN递减，TA、APH、APO、HU递增。有机酸与乙醇分布上，新窖泥中AA、BA、CA自上而下递减，LA递增；老窖泥呈单峰分布（峰在下层），AA与BA新窖泥略高（p>0.05），LA与乙醇老窖泥显著更高（p<0.01），CA显著更低（p<0.01）。酒醅中水平方向距窖泥越远，新窖酒醅AA递减、老窖酒醅AA递增，BA与CA两者均递减，LA与乙醇两者均递增；垂直方向新窖酒醅LA与BA空间变异显著（p<0.05），老窖酒醅AA与CA变异显著（p<0.05）；同位置老窖酒醅AA、LA、CA显著更高（p<0.05），乙醇与BA显著更低（p<0.05）。酒醅理化性质（水分、pH、TA）在新老窖内均具显著空间异质性。3.2 微生物群落结构与差异：测序稀释曲线平稳，表明深度足够。种水平上新窖泥优势类群为耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans，51.28%）、热丁酸梭菌（Clostridium thermobutyricum，14.21%）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum，13.63%）、硝酸还原加西亚氏菌（Garciella nitratireducens，13.49%）等；老窖泥优势类群为耐酸乳杆菌（18.89%）、产乳酸己酸杆菌（Caproicibacterium lactatifermentans，17.60%）、硫还原彼得罗单胞菌（Petrimonas sulfuriphila，12.91%）、克氏梭菌（Clostridium kluyveri，10.32%）等。窖泥垂直上层与中层微生物组成相似，下层与底层相似但优势类群跨层不同：老窖泥下层与底层因黄水（huangshui）沉积富营养与高乳酸选择出耐酸与利用乳酸微生物（如产乳酸己酸杆菌、克氏梭菌），这种分化随窖龄加剧。酒醅中耐酸乳杆菌与金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillus jinshanensis）合计占>99.90%；新窖酒醅以耐酸乳杆菌为主（56.39%），金山醋酸乳杆菌次之（43.60%）；老窖酒醅反转，金山醋酸乳杆菌为主（86.92%），耐酸乳杆菌次之（13.07%）。空间上酒醅距窖泥越远，耐酸乳杆菌相对丰度下降，金山醋酸乳杆菌上升，显示窖泥来源微生物影响酒醅群落；金山醋酸乳杆菌丰度空间变化趋势与TA一致，酸度是调控因素：金山醋酸乳杆菌适pH 3.5且产酸活跃，耐酸乳杆菌适pH 5.0，高酸胁迫下耐酸乳杆菌生长受抑且产酸能力下降，金山醋酸乳杆菌维持强化产酸，故老窖酒醅TA显著更高。两物种在窖泥与酒醅均有检出，提示基质间微生物交换。LEfSe分析新窖泥 biomarker（LDA>2）为耐酸乳杆菌、热丁酸梭菌、酪丁酸梭菌、硝酸还原加西亚氏菌等6个；老窖泥为产乳酸己酸杆菌、硫还原彼得罗单胞菌、克氏梭菌等16个；老窖泥各层 biomarker数量更均匀（顶5、中5、下4、底2），新窖泥为顶2、中3、下0、底1，表明老窖功能更复杂。3.3 微生物群落多样性与群落组装：Richness与Shannon指数显示窖泥细菌多样性显著高于酒醅（p<0.05）；酒醅水平方向距窖泥越远指数锐减后趋稳（新窖过JPB后稳，老窖过JPC后稳），表明窖泥微生物影响酒醅且老窖影响范围更大；窖泥垂直新窖多样性随深度递减，老窖先升后降（峰在中层）；老窖泥总体多样性更高。NMDS与PERMANOVA显示窖泥与酒醅群落显著差异（p=0.001，R²=0.034），新老窖之间（窖泥R²=0.312，p=0.001；酒醅R²=0.299，p=0.001），窖泥内四个空间位置差异显著（新窖R²=0.314，p=0.009；老窖R²=0.312，p=0.007）。MST分析显示新窖泥顶层与底层确定性过程主导（MST<0.5），中层与下层随机过程主导（MST>0.5）；老窖泥所有层均为确定性过程主导，表明长期发酵下理化参数（pH、水分、LA、AN等）驱动功能微生物定向富集。3.4 挥发性有机化合物（VOC）组成分析：共检出92种VOC（酯51、醇10、酸14、芳香7、其他10）。新窖中酯占窖泥96.98%-98.23%、酒醅92.92%-96.44%；老窖酯占比降低（窖泥38.60%-68.37%，酒醅61.50%-89.96%），酸占比升高（窖泥20.22%-49.10%，酒醅2.79%-30.90%），酯仍为各类样本首要VOC类别，但老窖酸贡献显著更大。垂直方向新窖泥总VOC中层与下层显著高于顶层与底层（p<0.01），峰在中层；老窖泥总VOC下层与底层显著更高（p<0.01），峰在下层；酒醅总VOC随深度显著递增（p<0.05），底层最大，老窖各层均高于新窖（p<0.05）；水平方向酒醅总VOC距窖泥越远显著递减（p<0.05），新窖过JPC稳，老窖持续降至JPE，老窖泥影响范围更大。四大乙酯（乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、丁酸乙酯）水平方向距窖泥越远，乙酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯显著递减（p<0.05），乳酸乙酯显著递增（p<0.05）；垂直方向四类乙酯自上而下递减；同层老窖乙酸乙酯与己酸乙酯显著更高（p<0.05），乳酸乙酯与丁酸乙酯显著更低（p<0.05）。3.5 VOC组成差异与差异化合物鉴定：(O)PLS-DA显示邻接窖泥的JPA与无直接接触窖泥的JPB-JPE聚类分离明显，表明窖泥对JPA的VOC形成影响远强于远端酒醅；窖泥不同层VOC谱聚类分离（上层与中层聚一类，下层与底层聚一类），与微生物趋势一致。新老窖对比窖泥差异VOC共63种（上调51、下调12），酒醅差异VOC共51种（上调36、下调15）。新老窖内JPA与JPE对比：新窖差异VOC 41种（上调6、下调35），老窖42种（上调2、下调40），JPA富集更多酯与酸（新窖如庚酸乙酯、己酸异戊酯；老窖如2-甲基戊酸、苯甲酸乙酯、对甲酚等）。3.6 微生物与风味化合物关联分析：Spearman相关网络（｜ρ｜>0.6，p<0.05）显示新窖泥中硝酸还原加西亚氏菌、副肠膜明串珠菌（Weissella paramesenteroides）与多数VOC正相关，酪丁酸梭菌与酯和乙醇显著负相关；新窖酒醅中副肠膜明串珠菌、热丁酸梭菌与多数VOC正相关，耐酸乳杆菌、硝酸还原加西亚氏菌、Caproicibacter sp. BJN0012与酸及酯显著负相关；老窖泥中克氏梭菌、耐酸乳杆菌、硫还原彼得罗单胞菌、不嗜糖塞加特氏菌（Segatella asaccharophila）与多数酯和乙醇显著正相关，Caloramator sp.、Caproicibacter sp. BJN0012、申氏互营乙酸菌（Syntrophaceticus schinkii）与VOC多为负相关；老窖酒醅中不嗜糖塞加特氏菌、克氏梭菌、丙酸蛋白噬菌（Proteiniphilum propionicum）、发酵Limibacterium fermenti与多数VOC正相关，Caldicoprobacter sp.、金山醋酸乳杆菌显著负相关。老窖中窖泥微生物与VOC（窖泥与酒醅）相关更强且多为正关联，表明成熟窖泥微生物增强关键风味化合物合成。金山醋酸乳杆菌在老窖酒醅中与多种VOC负相关，提示其可能通过微生物协同互作而非直接产风味物贡献。3.7 窖泥微生物群落分化驱动因素探索：Mantel检验显示不同垂直层细菌门类（Bacillota、Bacteroidota、Actinobacteria）与理化参数的相关模式各异：顶层Bacillota与水分、AN、HU、LA、CA正相关，Bacteroidota与水分、AN、APH、CA正相关；中层三者均与水分、AN、APH、APO、CA正相关，Bacillota与Bacteroidota还与HU、LA相关；下层三者均与TA、CA正相关，Bacillota与AA相关且还与水分、AN、APH、pH、HU相关，Bacteroidota与水分、AN、APH相关，Actinobacteria与AA相关；底层三者均与AN、CA正相关，Bacillota与Bacteroidota与APO相关，Bacteroidota与Actinobacteria与LA相关。RDA显示各层显著驱动因子不同：顶层全部理化参数显著；中层除BA与TA外均显著；下层除LA外均显著（RDA1 64.12%）；底层CA、AN、APO为主要驱动（RDA1 67.57%）。表明分层窖泥群落结构由不同理化因子塑造，长期发酵中理化参数驱动窖泥微生物空间异质性，进而影响不同位置酒醅群落与VOC差异。3.8 理化指标、微生物因子与VOC的关系：PLS-PM模型拟合可接受（新窖GOF=0.619，老窖GOF=0.616）。新窖中理化参数与四大有机酸显著影响细菌群落结构与多样性（路径系数b=0.688，p<0.05；b=0.611，p<0.05；b=0.534，p=0.01），细菌多样性负影响JPA VOC（b=-0.592，p<0.01），细菌结构正影响窖泥VOC（b=0.592，p<0.01），窖泥VOC负关联酒醅VOC（b=-0.362，p<0.01），JPA VOC最强直接正影响酒醅VOC（b=0.837，p<0.001），解释酒醅VOC方差71.9%，JPA VOC总效应标准系数0.837最大。老窖中理化参数与有机酸强烈促进细菌结构（b=1.185，p<0.001；b=0.582，p<0.05），细菌属性对窖泥与JPA VOC影响不显著（p>0.05），窖泥VOC正影响JPA VOC（b=0.678，p<0.01），JPA VOC最强直接正影响酒醅VOC（b=0.924，p<0.001），解释方差63.1%，JPA VOC总效应0.924最大；老窖细菌结构与多样性与JPA VOC为正但不显著，不排除少数关键类群（非整体结构多样性）驱动风味形成。两窖龄均显示JPA VOC对整体酒醅VOC最强直接影响，窖泥性质通过影响窖泥VOC与JPA VOC进而级联影响酒醅整体风味，该级联关联新老窖保守但路径强度与显著性不同，老窖细菌群落受环境调制更强。讨论部分总结：窖龄与空间位置均关联发酵特征差异，窖龄影响更强；老窖泥营养积累更高、微生物多样性更高、空间分层更明显，表明长期使用下微生物渐进适应与富集。酒醅中存在清晰空间梯度，微生物结构、有机酸、VOC谱随距窖泥距离变异，提示窖泥与酒醅间微生物迁移与代谢物质交换的潜在互作。关键乳酸菌（耐酸乳杆菌与金山醋酸乳杆菌）的差异分布与酸度及VOC组成空间变异相关。PLS-PM提示级联关联：窖泥理化参数、微生物群落特征与酒醅VOC相互联结，模式新老窖相似但路径强度与显著性不同。鉴于本研究观察性质，这些关系应解释为统计关联而非实验验证因果机制。结论部分翻译：本研究为窖泥与酒醅微生物群落及代谢谱空间异质性之间的关联提供了见解。通过整合理化、微生物学与代谢组学分析，研究人员观察到窖龄与空间位置均关联发酵特征差异，窖龄影响相对更强。老窖泥相比新窖泥表现出增强的营养积累、更高的微生物多样性及更强的空间分层，提示长期窖池使用过程中渐进的微生物适应与富集。酒醅中观察到清晰的空间梯度，微生物群落结构、有机酸及VOC谱随距窖泥距离增加而变异，表明窖泥与酒醅可能通过微生物交换与代谢物扩散发生互作。关键乳酸菌特别是耐酸乳杆菌（Lactobacillus acetotolerans）与金山醋酸乳杆菌（Acetilactobacillus jinshanensis）的差异分布模式也与不同空间位置的酸度及VOC组成变异相关。重要的是，PLS-PM分析提示一种可能的级联关联，即窖泥理化参数、微生物群落特征与酒醅VOC相互联结；此类关联模式在不同窖龄中均可观察到，但路径强度与显著性新旧系统间存在差异。总体而言，研究结果表明窖泥关联的环境与微生物因子可能促成酒醅微生物群落及代谢输出的空间异质性，从而影响浓香型白酒的风味变异。这些结果为进一步研究白酒发酵 underlying 微生态过程及朝向发酵优化与品质调控提供了基础。