去唾液酸糖蛋白受体亚基 ASGR1 缺失减弱西方饮食喂养斑马鱼胆固醇吸收

《Journal of Biological Chemistry》：Asialoglycoprotein receptor subunit asgr1a loss results in attenuated cholesterol absorption in zebrafish fed a Western diet

　　

摘要：清除循环中糖蛋白的主要途径之一是通过肝脏特异性的去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR）。人 ASGPR 主要亚基 ASGR1（asialoglycoprotein receptor 1）基因缺失与血浆含载脂蛋白 B 脂蛋白（apolipoprotein B-containing lipoproteins, B-lps）水平降低及心血管疾病风险显著下降相关，但其细胞与分子机制尚不清楚。鉴于啮齿类动物胆固醇主要由高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）运输，研究人员选用斑马鱼模型以阐明 ASGR1 的作用机制。研究人员首先从凝集素结合蛋白中鉴定斑马鱼 ASGR1 直系同源基因 asgr1a，并利用 CRISPR/Cas9 构建两个独立的 asgr1a 突变体。两种突变均未改变幼体、稚鱼或成鱼的 B-lp 数量与粒径。然而，经西方饮食（Western Diet, WD）挑战后，asgr1a 突变体斑马鱼较对照动物表现出更轻的肝脏脂肪变性（hepatic steatosis）及更低的肝内甘油三酯水平；asgr1a 突变体粪便胆固醇排泄增加，源于餐后胆固醇吸收减弱及肝脏参与 B-lp 代谢的蛋白（如微体甘油三酯转运蛋白 microsomal triglyceride transfer protein, Mttp 和载脂蛋白 A-IV apolipoprotein A-IV, ApoA4）上调。上述数据印证了 ASGR1 缺失的心血管保护作用，并揭示 ASGR1 此前未被认识的调控整体动物胆固醇流（cholesterol flux）的功能。

论文解读——《Journal of Biological Chemistry》发表研究：斑马鱼 asgr1a 缺失减弱西方饮食诱导的胆固醇吸收并减轻肝脂肪变性

一、研究背景与立题依据

去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, ASGPR）是肝脏特异性 C 型凝集素受体，由 ASGR1 和 ASGR2 亚基组成，可结合循环中去唾液酸的末端半乳糖/N-乙酰半乳糖胺（Gal/GalNAc）修饰糖蛋白并经网格蛋白介导内吞清除。全基因组关联研究（GWAS）发现，人 ASGR1 杂合缺失与血浆含载脂蛋白 B 脂蛋白（B-lps，含极低密度脂蛋白 VLDL、低密度脂蛋白 LDL）水平降低及动脉粥样硬化性心血管疾病（CVD）风险下降相关，但其保护机制存在争议——传统观点认为 ASGPR 可结合并摄取去唾液酸 B-lps，而 ASGR1 缺失按理应减少肝脏 B-lp 清除、升高血浆 LDL，与 GWAS 表型矛盾。近期小鼠及细胞实验提出 ASGR1 缺失可通过固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element–binding proteins, SREBPs）/前蛋白转化酶枯草溶菌素 9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9, PCSK9）通路或肝 X 受体（liver X receptor, LXR）/ATP 结合盒转运蛋白 G5/G8（ATP-binding cassette transporters G5/G8, ABCG5/G8）通路影响低密度脂蛋白受体（low-density lipoprotein receptor, LDLR）表达或胆固醇逆向转运，但这些机制尚未统一，且小鼠主要经 HDL 转运胆固醇，与人脂蛋白谱存在差异。为此，研究人员选用脂蛋白谱更接近人类（含载脂蛋白 B 脂蛋白 apoBb.1 及胆固醇酯转运蛋白 cholesteryl ester transfer protein, CETP）、具备可定制高脂饮食及活体脂蛋白报告系统的斑马鱼（Danio rerio）模型，鉴定其 ASGR1 直系同源基因并探究缺失后对胆固醇代谢的影响。

二、主要关键技术方法概述

研究人员采用野生型 AB 品系及 LipoGlo 脂蛋白报告（apoBb.1^Nluc/+，将 NanoLuc 融合于内源性 ApoBb.1 C 端以通过化学发光定量 B-lp 数量与粒径）斑马鱼。首先通过 BLASTp、多序列比对（MAFFT）、邻接法系统发育树构建及同线性（synteny）分析从斑马鱼基因组候选 C 型凝集素家族基因中筛选 ASGR1 直系同源基因，并以整体原位杂交（whole-mount in situ hybridization, WISH）验证肝脏特异性表达确定 asgr1a。利用 CRISPR/Cas9 靶向 asgr1a 外显子 2 起始密码子区（产生 5 bp 缺失，等位基因 c830）和外显子 9 C 型凝集素结构域（产生 33 bp 缺失，等位基因 c865）构建两个独立纯合敲除系。正常饲喂及西方饮食（WD：8% 果糖、7.5% 大豆油、8% 棕榈油、4% 胆固醇，每日两次喂 6 天）后，取雄性成鱼血浆行 LipoGlo 计数与 native-PAGE 电泳分析 B-lp；取肝脏行苏木精–伊红（hematoxylin and eosin, H&E）染色量化脂肪变性面积、高效液相色谱–电雾式检测器（high-performance liquid chromatography with charged aerosol detection, HPLC-CAD）测定甘油三酯与游离/酯化胆固醇；收集粪便 HPLC-CAD 测胆固醇含量。部分实验 WD 中添加 1% BODIPY-胆固醇，于餐后 3 h 和 2 d 取肝与肠组织 HPLC 荧光检测以评估吸收与转运。对 WD 喂养雄鱼肝脏行 RNA-seq（DESeq2/PyDeseq2 差异分析、DAVID KEGG 通路富集）及液相色谱–串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学（Proteome Discoverer 搜库、Minora 特征定量）。

三、研究结果

In silico analysis suggests complicated evolution of asgr1 in zebrafish（斑马鱼 asgr1 基因进化的生物信息学分析）

通过人 ASGR1 蛋白 BLASTp 检索斑马鱼基因组获 5 个候选基因，经多序列比对显示 si:ch73-361h17.1 与人 ASGR1 氨基酸一致性最高（42.4%）；系统发育树将其与哺乳动物 ASGR1 聚为一支；同线性分析显示人 17 号染色体 ASGR1 邻近基因在斑马鱼 5 号及 23 号染色体存在共线块，确认 si:ch73-361h17.1（命名 asgr1a）为功能直系同源，其余为沉默旁系同源 asgr1b、asgr1c.1/asgr1c.2 及肝脏表达但亲缘较远的 asgr1-like（asgr1l）。结论：斑马鱼 asgr1a 是与人 ASGR1 最匹配的活性同源基因。

mRNA expression pattern of candidate zebrafish asgr1 paralogs（斑马鱼 asgr1 旁系同源基因 mRNA 表达模式）

WISH 显示 asgr1a（si:ch73-361h17.1）与 asgr1l（si:ch211-170d8.5）在 3–5 dpf 幼虫肝脏特异性表达，asgr1a 信号更稳定（4 dpf 起 36/36 条鱼阳性），其余候选无信号。结论：asgr1a 具有与人 ASGR1 一致的肝脏限制性表达模式，被确定为研究靶基因。

Generation of two asgr1a mutant zebrafish lines（两种 asgr1a 突变斑马鱼系的建立）

CRISPR/Cas9 分别引入 asgr1a 外显子 2 的 5 bp 缺失（asgr1a^c830/c830，预测提前终止于第 26 位氨基酸）和外显子 9 C 型凝集素域的 33 bp 缺失（asgr1a^c865/c865，丢失 9 个保守氨基酸，全长缩至 288 aa）。两纯合突变体可存活、发育正常、正常饲喂下 6 月龄体长体重与野生型无差异。结论：成功构建两个独立、无发育缺陷的 asgr1a 功能缺失斑马鱼系。

asgr1a mutants do not exhibit changes in B-lp number or particle size（asgr1a 突变体 B-lp 数量与粒径无改变）

将两 asgr1a 突变与 LipoGlo 报告系杂交，检测幼虫、稚鱼及成鱼血浆/匀浆 NanoLuc 信号与 native-PAGE 电泳条带，在正常饲喂条件下 asgr1a 突变体与野生型同胞相比 B-lp 数量及 VLDL/IDL/LDL 粒径分布无显著差异。结论：asgr1a 缺失本身不改变基础状态下斑马鱼循环 B-lp 谱。

asgr1a mutants are protected from WD-induced hepatic steatosis and excrete excess more fecal cholesterol than wild-type siblings（asgr1a 突变体抵抗 WD 诱导的肝脂肪变性并排泄更多粪便胆固醇）

雄性成鱼喂 WD 6 d 后，突变体血浆 B-lp 数量和粒径仍与对照无差异；H&E 示突变体肝脂肪变性面积显著低于对照（野生型 20.06%±7.83%，c830 13.82%±5.08%，c865 12.90%±5.06%，p=0.000001）；HPLC 示肝内甘油三酯含量较对照降低约 20%（p<0.01）；粪便 HPLC 示突变体粪便胆固醇占比显著高于对照（野生型 43%±5.8%，c830 67%±17%，c865 56%±7.4%，p<0.01）。雌性无此表型。结论：WD 挑战下 asgr1a 缺失减轻雄性斑马鱼肝脂肪变性与甘油三酯蓄积，并促进膳食胆固醇经粪便排出而非肝摄取。

WD induces changes in expression of metabolic processing genes and proteins in asgr1a mutants（WD 诱导 asgr1a 突变体代谢加工基因与蛋白表达改变）

WD 喂养雄鱼肝脏 RNA-seq 显示 KEGG 下调类固醇生物合成与脂质代谢通路，上调免疫与铁死亡相关通路；差异基因包括 neu3.3（唾液酶，上调）、hsd17b12a（长链脂肪酸合成酶相关，上调）、cited4a（脂滴形成抑制因子，下调）、bco1 与 slc5a6b（动脉粥样硬化保护相关，上调）、anxa2b/fgf20b/gpx1（肝健康相关，上调），ldlra、cyp7a1、cyp8b1.3 呈非显著下调趋势，asgr1c.1（旁系同源）转录上调。蛋白质组学显示突变体肝脏微体甘油三酯转运蛋白（Mttp）上调约 12 倍、载脂蛋白 A-IV（ApoA4b.2）约 14 倍、肝脂肪酸结合蛋白 Fabp10a 约 100 倍，但相应 mRNA 无显著变化。结论：asgr1a 缺失在 WD 下引发肝脏特异性蛋白（Mttp、ApoA4）显著上调及脂质代谢/免疫相关基因重编程，可能参与胆固醇吸收调控。

asgr1a^c830/c830mutants absorb less BODIPY-cholesterol directly from a WD（asgr1a^c830/c830突变体直接从 WD 吸收 BODIPY-胆固醇减少）

WD 添加 1% BODIPY-胆固醇喂雄鱼，餐后 3 h 突变体肝总 BODIPY-胆固醇及胆固醇酯峰面积仅为野生型约 1/5（p=0.041），肠胆固醇酯亦偏低（未达显著），肝+肠总吸收胆固醇约为野生型 1/3（p=0.031）；餐后 2 d 肝残留 BODIPY-胆固醇无显著差异。结论：asgr1a 缺失致肠道餐后膳食胆固醇吸收减弱，多余胆固醇未被吸收而入粪便，是粪便胆固醇升高的直接原因。

四、讨论与结论翻译（总结讨论部分核心结论）

同期研究表明 ASGR1 缺失降 LDL-C 与 CVD 风险的机制可能涉及肝细胞表面 LDLR 上调（细胞/猪模型，通过 ASGR1 结合并促进 LDLR 降解或 SREBP–PCSK9 通路或 LXR–ABC 转运体通路），各模型在 B-lp 数量/粒径上存在分歧但均报道粪便胆固醇增加。本研究通过系统发育、同线性及 WISH 明确斑马鱼 asgr1a 为人 ASGR1 直系同源；构建两独立敲除系证实正常条件下 asgr1a 缺失不影响 B-lp 谱，但 WD 下突变体肝脂肪变性减轻、粪便胆固醇增多，且荧光胆固醇示踪证明吸收减少是粪便胆固醇升高的机制；肝脏 Mttp 与 ApoA4 蛋白（非转录水平）显著上调，伴随脂质代谢基因下调及免疫通路激活；部分表型可能受沉默旁系同源 asgr1c 补偿影响。综上，斑马鱼研究强调 ASGR1 在 WD 背景下调控总体粪便固醇水平与肝脂肪变性的作用，可部分解释人 ASGR1 功能减弱具心脏保护作用的 GWAS 发现，但 ASGR1 功能与粪便固醇水平关联的精确细胞分子机制仍有待阐明。