溶菌酶和银阳极处理对原料乳中铜绿假单胞菌生长和生物膜形成的影响

《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Effects of Lysozyme and Silver Anode Treatment on Pseudomonas aeruginosa Growth and Biofilm Formation in Raw Milk

　　

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是原料乳中重要的腐败相关和机会性病原体，能产生耐热酶和强健的生物膜（biofilm），抵抗传统卫生措施。现有净化方法的局限性催生了新型非热环保策略的需求。本研究评估了溶菌酶（lysozyme）联合银阳极技术（silver anode technique, SAT）对原料乳中铜绿假单胞菌ATCC 27853的抗菌和抗生物膜效果。通过纸片扩散法测得溶菌酶的最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration, MIC）为8 g/100 mL。原料乳样品被分为八个实验组：未处理对照组、单独溶菌酶组、单独SAT组及其联合组。在72 h冷藏期间监测细菌计数（log CFU/mL）和生物膜形成（结晶紫法），并通过电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS）定量银离子迁移。单独溶菌酶主要呈现抑菌作用，而单独SAT产生杀菌性减少（最高1.5–2 log）。联合处理使浮游菌计数降低最高2.5 log，生物膜降低最高78%。这些减少幅度大于任一单独处理，但作用为相加性（additive），而非严格协同。银迁移量（3.88 μg/L）对应成人每日摄入0.055 μg/kg（按饮用1 L计算），远低于美国环保局（EPA）的5 μg/kg/day和欧洲食品安全局（EFSA）的50 μg/kg食品限量。该联合策略提供了一种有效、非热、环保的乳品预处理方法，可延长货架期、减少生物膜污染并最小化化学消毒剂使用，符合绿色技术理念。

**论文解读：溶菌酶与银阳极技术联合控制原料乳中铜绿假单胞菌的研究**

**研究背景与目的**

原料乳营养丰富，易受微生物污染，其中嗜冷菌（psychrotrophic bacteria）在冷藏条件下仍能生长，对乳品货架期和加工品质构成严重威胁。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种重要的腐败相关和机会性病原体，广泛存在于自然环境中，可通过不卫生的挤奶条件进入原料乳，并在冷藏期间快速增殖。该菌能产生耐热的蛋白酶和脂肪酶，常规热处理无法使其失活，导致乳品在储藏过程中出现酸败、凝胶化等不可逆的品质缺陷。更棘手的是，铜绿假单胞菌可附着于乳品加工设备表面形成生物膜（biofilm），生物膜由细菌自身分泌的胞外多糖（exopolysaccharide, EPS）基质包裹，形成坚固屏障，使其抵抗消毒剂、抗菌剂和环境胁迫。传统清洗消毒方案对这类耐药结构效果有限，亟需开发创新且环保的控制策略。天然抗菌物质和物理化学干预措施展现出潜力：溶菌酶（lysozyme）虽然主要作用于革兰氏阳性菌的细胞壁，但其阳离子特性可干扰革兰氏阴性菌（如铜绿假单胞菌）的外膜，并可能抑制生物膜形成；银离子（silver ions, Ag⁺）具有寡动态效应（oligodynamic effect），低浓度下即可广谱抗菌，通过抑制呼吸酶、破坏膜通透性、干扰核酸等机制杀死细菌，银阳极技术（silver anode technique, SAT）可通过电流调控银离子释放，持续发挥效力。然而，将这两种不同作用机制的抗菌剂联合应用于原料乳这一复杂食品基质中的研究尚属空白。研究人员假设，溶菌酶对细胞表面的损伤可促进银离子进入细胞，从而增强杀菌效果，尤其是对抗常规方法难以清除的生物膜结构。本研究旨在评估溶菌酶与SAT联合对原料乳中铜绿假单胞菌ATCC 27853浮游态和生物膜态的抑制效果，并测定银离子迁移安全性，为开发非热、环保的乳品预处理策略提供依据。论文发表在《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》。

**关键方法技术**

研究人员采用了以下主要技术方法：（1）纸片扩散法（disk diffusion method）测定溶菌酶的最低抑菌浓度（MIC）；（2）Taguchi优化设计确定SAT的最佳电流（20 μA）和作用时间（60 s）；（3）选择性培养基（Cetrimide Agar, CA）平板计数法评估抗菌活性，在+4°C冷藏条件下于初始、24、48、72 h四个时间点取样计数（log CFU/mL）；（4）96孔微孔板结晶紫法（crystal violet assay）测定生物膜形成抑制率，以OD₆₃₀吸光度值表征；（5）电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）定量银离子迁移量。样本来源：原料乳取自Cattle Breeders' Association，经无菌采集；细菌为标准菌株铜绿假单胞菌ATCC 27853。

**研究结果**

**3.1 化学分析结果（Chemical Analysis Results）**
原料乳的基本组成（脂肪3.78%、蛋白质3.50%、乳糖4.46%、水分87.32%、pH 6.68）均在典型范围内，符合当地生乳标准，说明实验用乳基质具有代表性。

**3.2 溶菌酶MIC和银阳极参数的确定（Determination of Lysozyme MIC and Silver Anode Parameters）**
通过纸片扩散法，针对铜绿假单胞菌ATCC 27853的溶菌酶MIC为8 g/100 mL（8% w/v），该较高浓度表明溶菌酶穿透革兰氏阴性菌外膜存在障碍。先前Taguchi优化研究（Cibik和Duran, 2023）确定，在原料乳中20 μA电流作用60 s可获得最大抗菌效果（降低1.31 log CFU/mL），因此本研究中SAT均采用此优化参数。

**3.3 贮藏期间抗菌活性的变化（Changes in Antibacterial Activity During Storage）**
在72 h冷藏期间，单独溶菌酶处理组（C2、C3）与对照组相比未出现显著菌数下降，主要呈现抑菌作用。单独SAT处理组（C4、C5）在应用后立即检测到约1 log减少，至72 h时达1.5–2 log减少，表明SAT具有强力杀菌作用，且银离子的残留效应（residual effect）维持了持续效力。联合处理组（C6、C7）在应用后减少超过1 log，至72 h时总细菌减少达2–2.5 log CFU/mL。将联合处理减少量（接种乳中72 h为2.53 log）与单独减少量之和（溶菌酶0.75 log + SAT 2.06 log = 2.81 log）比较，联合效果未超过相加值，故描述为相加性至略微增强，而非严格协同。

**3.4 对生物膜抑制的影响（Effects on Biofilm Inhibition）**
生物膜分析采用微孔板结晶紫法，计算抑制率。单独溶菌酶对自然菌群和接种菌群的生物膜抑制率分别为47%和40%；单独SAT分别达62%和58%；联合处理（C7、C6）获得最高抑制率，分别为75%和78%。这表明联合策略不仅作用于浮游细胞，对包裹在保护性生物膜基质内的细胞同样有效，溶菌酶干扰生物膜结构的胞外聚合物或细胞间相互作用，使SAT能更深入渗透生物膜。

**3.5 安全性评估：银离子迁移至乳中（Safety Assessment: Silver Migration Into Milk）**
ICP-MS测定显示，单次SAT处理（20 μA, 60 s）后乳中银离子（Ag⁺）迁移量为3.882 ± 0.01 μg/L。按70 kg成人体重每天饮用1 L计算，每日摄入量为0.055 μg/kg，远低于美国EPA的口服参考剂量5 μg/kg/day，也低于欧洲EFSA对食品接触材料中银的迁移限量50 μg/kg食品。该数据来源于单次静态实验室条件，未评估重复或工业级应用下的累积风险，但在此测试条件下银迁移量极低且符合安全限值。

**3.6 总体评价与工业启示（General Evaluation and Industrial Implications）**
研究证明，溶菌酶与SAT联合对原料乳中铜绿假单胞菌浮游态和生物膜态的效果均显著优于单一处理，增强效力源于互补机制：溶菌酶阳离子性质破坏革兰氏阴性菌外膜稳定性，促进电化学产生的银离子深入细胞，银离子再发挥多靶点杀菌作用。该联合策略可推荐为乳品加工厂的非热、环保预处理方案，能延长原料乳货架期、减少管道和储罐中持续性生物膜污染、降低耐热酶生成、减少化学消毒剂使用。

**结论翻译**
这项实验室规模研究成功证明，溶菌酶与SAT联合对原料乳中铜绿假单胞菌产生了明确且显著的抗菌和抗生物膜效果。联合处理使浮游细菌计数降低最高2.5 log CFU/mL，生物膜形成抑制最高达78%，两者均显著优于任一单独处理。这些结果凸显了这种双重方法作为乳品应用中非热、环保干预策略的潜力。观察到的增强作用可通过互补机制解释：溶菌酶的阳离子膜失稳作用可能促进了电化学产生的银离子进入细菌细胞，从而增加其致死效应。因此，这种组合将主要抑菌作用（单独溶菌酶）转变为明确的杀菌作用。
该发现对乳品行业具有重要启示。溶菌酶+SAT组合提供了一种实用且环保的替代传统化学消毒剂的方法，有望延长原料乳货架期、减少加工设备中生物膜相关污染、限制耐热腐败酶的形成以及最小化化学消毒剂残留。此外，低电流SAT确保能源效率，而溶菌酶是天然存在于乳汁和蛋清中的酶，使该策略符合绿色技术原则。
然而，应承认某些局限性以正确解读结论。本研究使用了单一参考菌株（铜绿假单胞菌ATCC 27853）在静态培养皿条件下进行，而非工业表面或连续流条件。未进行正式协同测试（如棋盘法或等效应图法），因此相互作用最好描述为相加性至略微增强，而非严格协同。银迁移量仅针对单次应用测量，未评估重复或连续使用场景。中试规模和工业验证仍有待开展。
尽管存在这些局限性，在受控条件下获得的阳性结果为进一步开发提供了有力依据。未来研究应测试针对现场分离株和多物种生物膜的效果，评估流动条件下不锈钢表面的效力，进行正式协同分析，评估重复应用下的银累积，并开展中试规模试验。总之，溶菌酶与SAT联合代表了控制原料乳中铜绿假单胞菌的一项有前景、创新且可持续的策略，值得继续研究以迈向工业应用。