UV-A光增强乳糖酸对金黄色葡萄球菌与大肠杆菌菌株的抗菌活性

《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：UV-A Light-Enhanced Antibacterial Activity of Lactobionic Acid Against Staphylococcus aureus and Escherichia coli Strains

　　

乳糖酸（LBA）因其多重特性而得到日益广泛的应用，包括防腐作用和益生元作用。为增强其抗菌效能，本研究探讨了其与亚致死水平紫外A（UV-A）光联用以对抗食源性细菌的相互作用。首先，采用微量稀释法测定该酸对金黄色葡萄球菌IPL A1、金黄色葡萄球菌CECT 240和大肠杆菌CECT 101的抗菌作用。3株菌均对该酸敏感，且对所有菌株而言，最低抑菌浓度（MIC）均低于最低杀菌浓度（MBC，25 mg/mL）。UV-A光可诱导可逆性失活，但其显著增强了LBA的效力。进一步地，流式细胞术分析显示，同时采用LBA与UV-A处理可改变膜通透性并影响酯酶活性。扫描电子显微镜（SEM）证实了受试因子对形态结构的影响，图像显示出结构变形及细胞团聚。含LBA的淀粉基薄膜在1/2 MIC和1 MIC添加水平下于肉汤培养基中表现出抗菌潜力，且UV-A处理增强了其有效性。关于食品应用，所制备薄膜在冷藏贮藏条件下对奶酪片具有有效的微生物保藏作用，而UV-A与LBA-薄膜同步应用可实现细菌的完全清除。总体而言，本研究凸显了LBA–UV-A联合处理在控制食品中细菌增殖方面的有效性。

该论文发表于《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》，研究聚焦于食源性致病菌控制这一食品安全关键问题。食品中不良微生物及其分泌物是引发食源性疾病、食品浪费和经济损失的重要原因，其中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是典型代表。金黄色葡萄球菌不仅能够形成生物被膜（biofilm，附着于表面的微生物聚集体），还可产生耐热毒素；大肠杆菌则常被视为粪便污染和卫生状况不良的指示菌。传统抑菌策略虽具一定效果，但现代食品工业更强调天然来源防腐剂与非激烈物理技术的结合，以在保障食品安全的同时尽可能维持营养品质与感官属性。因此，开发兼具安全性、温和性与高效性的复合抑菌技术，成为食品保藏领域的重要研究方向。

乳糖酸（LBA）作为一种弱有机酸（organic acid, OA），兼具螯合性、热稳定性和高水溶性，近年来在食品领域受到更多关注。既往研究提示，LBA对多种细菌具有抑制作用，并可改善易腐食品的微生物安全性。然而，单独使用有机酸在某些应用场景中的抑菌效力仍有限，特别是在复杂食品基质中。另一方面，紫外A（UV-A）光属于非热加工手段，相比UV-C，其对人体毒性较低，对食品品质影响较小，但单独杀菌能力偏弱，且容易产生亚致死损伤后细胞恢复的问题。基于此，将低剂量LBA与UV-A联用，构建“栅栏技术（hurdle technology，多重保藏因子协同抑菌策略）”，有望在不显著损害食品品质的前提下增强对细菌的控制效果。论文正是在这一背景下展开，旨在系统评估LBA、UV-A及其联合作用对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制效果，并进一步探索将LBA掺入淀粉基可食性薄膜后在奶酪片表面的实际应用潜力。

研究人员首先测定了LBA对3株受试菌的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），随后评估不同照射时间UV-A的单独抑菌效应及其可逆性，再考察LBA与UV-A同步处理时对菌体生长、形态结构和生理状态的影响。在应用层面，研究人员制备了掺入不同浓度LBA的淀粉基薄膜，并分别在肉汤培养体系和接种奶酪片体系中验证其抗菌活性，同时结合UV-A照射考察复合处理效果。最终研究表明，LBA对革兰氏阳性菌（Gram-positive bacteria）和革兰氏阴性菌（Gram-negative bacteria）均具有明确抑菌作用，UV-A虽单独仅产生非致死性抑制，但能够显著增强LBA的抗菌效力；当二者联用时，可造成菌体膜通透性改变、酯酶代谢活性下降及明显的形态损伤。进一步地，含LBA的淀粉基薄膜对肉汤和奶酪片中的细菌均表现出抑制作用，联合UV-A后效果更强，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌CECT 240可实现完全清除。研究说明，LBA与UV-A联合作为一种创新型食品保藏策略，具有较强应用潜力。

就主要技术方法而言，研究人员采用微量肉汤稀释法测定MIC与MBC；使用365 nm UV-A装置对菌悬液或覆膜样品实施15、30、45 min照射；通过菌落计数评价处理后的即时抑菌效应及12 h恢复情况。为阐明作用机制，研究采用扫描电子显微镜（SEM）观察细胞形态变化，并通过PI/CV6双染流式细胞术分析膜完整性与酯酶活性。应用研究中，研究人员制备含LBA的淀粉-甘油可食性薄膜，在肉汤培养基和人工接种的奶酪片冷藏模型中评估抑菌性能；奶酪样本来源为经无菌处理后人工接种约10⁶ CFU/g目标菌的奶酪切片。

在“3.1 MIC and MCB Determination”部分，研究人员通过微孔板稀释法得出LBA对3株菌均有抑制和杀灭活性。结果显示，金黄色葡萄球菌IPLA1的MIC为6.25 mg/mL，低于金黄色葡萄球菌CECT 240和大肠杆菌的12.5 mg/mL，说明前者对LBA更敏感。3株菌的MBC均为25 mg/mL，表明在该浓度下LBA对革兰氏阳性和阴性菌均表现出杀菌作用。这一结果构成了后续联合处理实验的剂量依据，也表明LBA具备作为天然抑菌剂的基础潜力。

在“3.2 Effect of UV Treatment”部分，研究人员通过设置不同UV-A照射时间并比较处理后即时菌落数及后续12 h培养结果，评估了UV-A单独处理的效应。结果表明，45 min UV-A可使大肠杆菌即时下降约3 log，使金黄色葡萄球菌CECT 240下降约2.5 log，而金黄色葡萄球菌IPLA1在15 min时已出现约2 log下降。然而，经37°C培养12 h后，处理组菌体出现明显恢复，提示UV-A所致抑制主要为可逆性亚致死损伤，而非彻底杀灭。由此可见，单独UV-A不足以实现稳定抑菌，需要与其他抑菌因子配合应用。

在“3.3 Combined Effect of UV-A and LBA Treatment on Bacterial Growth”部分，研究人员通过将LBA按1/2 MIC、1 MIC和2 MIC与45 min UV-A同步处理，分析两者间的联合作用。结果显示，LBA单独处理呈剂量依赖性抑菌；当2 MIC LBA与UV-A联用时，3株菌初始数量分别下降约3–4 log，并在12 h后完全消失，表现为杀菌效应。对1 MIC条件而言，联合处理较单独处理进一步增强抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌CECT 240和大肠杆菌可实现完全清除，对金黄色葡萄球菌IPLA1也显著降低菌数。这一部分说明，UV-A与LBA之间存在明显增强作用，支持二者可作为协同抑菌组合应用。

在“3.4 Scanning Electronic Microscopy”部分，研究人员利用SEM在处理6 h后观察菌体形态变化，从结构层面验证抑菌效应。未处理的金黄色葡萄球菌细胞表面光滑、呈规则球形；经LBA或LBA+UV-A处理后，细胞出现显著变形、塌陷和成团，且联合处理所致损伤更为严重。对于大肠杆菌，单独处理样本大多仍保持较完整细胞形态，而联合处理样本中可见细胞数量明显减少，并表现出体积缩小、表面扁平及结构异常。这些结果说明，LBA特别是在UV-A辅助下，可显著破坏细胞外部结构，为其抗菌机制提供了形态学证据。

在“3.5 Flow Cytometry Analysis”部分，研究人员采用PI/CV6双染流式细胞术评估膜通透性和代谢活性变化。PI阳性细胞代表膜受损细胞，CV6阳性细胞代表具有酯酶活性的代谢活细胞。结果表明，UV-A单独处理后各菌株总代谢活细胞比例与对照接近，而LBA尤其是LBA+UV-A处理显著提高PI染色比例、降低CV6阳性比例。对金黄色葡萄球菌CECT 240，LBA单独处理后PI阳性细胞达51.34%，而联合处理后细胞数量甚至低于流式检测阈值；对金黄色葡萄球菌IPLA1和大肠杆菌，联合处理同样显著增加膜损伤细胞比例。该部分结果表明，联合处理不仅影响细胞膜完整性，还削弱细胞代谢活性，是其增强抑菌作用的重要生理基础。

在“3.6 Film Antibacterial Activity”部分，研究重点转向LBA可食性薄膜的实际应用价值。于“3.6.1 Antibacterial Effect in Broth Medium”中，研究人员在液体培养体系中评估含LBA薄膜的抗菌能力，发现所有菌株在该体系下均出现菌数下降，且呈浓度依赖性。含1/2 MIC LBA薄膜的抑制作用较弱，但与UV-A联用后抑制明显增强；含1 MIC LBA薄膜联合UV-A对金黄色葡萄球菌IPLA1具有高度抑制，对其余两株菌则可实现完全抑制。该结果说明，LBA在薄膜中的缓释形式仍可发挥明显抗菌活性，且UV-A能够强化其效果。

在“3.6.2 Application of Films on Cheese Slices”部分，研究人员进一步在奶酪切片模型中验证LBA薄膜的应用可行性。其中“3.6.2.1 Qualitative Antibacterial Activity”通过平板接触法进行定性筛查，结果显示薄膜抗菌作用同样呈剂量依赖性。含2 MIC LBA薄膜对两株金黄色葡萄球菌呈现杀菌效应，并显著降低大肠杆菌负荷；含1/2 MIC和1 MIC LBA薄膜对大肠杆菌作用较弱，但对两株金黄色葡萄球菌已有明显抑制。基于这一结果，研究人员选择含1 MIC LBA薄膜用于后续定量研究。

在“3.6.2.2 Quantitative Antibacterial Activity”中，研究人员将接种菌的奶酪片分为对照组、单独UV-A组、单独LBA薄膜组以及LBA薄膜+UV-A组，并于4°C条件下贮藏观察。结果显示，对照组中两株金黄色葡萄球菌在前4 d内总体稳定，而大肠杆菌呈逐渐下降趋势。单独UV-A处理虽可降低菌数，但不能完全清除。LBA薄膜对不同菌株效果存在差异：对金黄色葡萄球菌IPLA1作用有限，对金黄色葡萄球菌CECT 240可降低约2.4 log/g，对大肠杆菌抑制更为明显。最突出的是联合处理组，其中大肠杆菌在贮藏第8天即被完全抑制，而对两株金黄色葡萄球菌在第14天可由约10⁶ CFU/g降至约10³ CFU/g水平。这说明在真实食品基质和冷藏条件下，LBA薄膜与UV-A联用仍具有较强的控制能力，是一种具有现实应用价值的复合保鲜策略。

综合讨论部分可见，论文围绕“天然有机酸+温和物理处理+活性包装”这一复合保藏思路，较系统地证明了LBA与UV-A之间的增强效应。单独UV-A易导致可恢复性损伤，单独LBA则受剂量与食品基质限制；二者联用后，既增强了细胞膜破坏和代谢失活，也在肉汤体系和奶酪实际模型中表现出更强抑菌效果。尤其在可食性淀粉薄膜载体中，LBA仍保有活性，并在UV-A辅助下进一步提高食品表面微生物控制能力。研究的重要意义在于，为开发天然来源、低热负荷、对食品品质影响较小的新型食品保藏技术提供了实验依据，并为LBA在活性包装和冷藏即食乳制品中的应用拓展了场景。

研究结论部分可译为：本研究考察了LBA对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑制效能。在25 mg/mL时，该酸可完全杀灭所有受试菌株。UV-A光单独处理表现出非致死性抗菌活性，但无论对何种细菌类群，均能令人满意地增强LBA的效力。UV-A光与LBA的双重处理可诱导形态学和生理学改变。含1 MIC LBA的薄膜同样能够有效抑制细菌生长，降幅依菌株不同而为6.5–8.42 log/mL。将含酸薄膜与UV-A光结合后获得了显著效果，在37°C下处理4 h即可完全清除大肠杆菌和金黄色葡萄球菌CECT。对接种奶酪同步施加UV-A光与LBA-薄膜，对不良细菌构成了强有力的栅栏。于该条件下，大肠杆菌菌株在第8天被完全抑制，而两株金黄色葡萄球菌在第14天的细胞计数由10⁶降至约10³。因此，这些结果支持将上述两种处理因子联合作为控制金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的创新策略的重要性。然而，支撑这一潜力的作用方式仍有待进一步阐明。此外，还需在更广泛的细菌谱范围内进行验证，并评估这些处理对食品理化特性的影响。