溶剂驱动下爱琴海地区特级初榨橄榄油抗氧化能力与氧化应激指标测定的差异

《Foods》：Solvent-Driven Variation in the Determination of Antioxidant Capacity and Oxidative Stress Indicators of Extra Virgin Olive Oils from the Aegean Region

　　

本研究调查了不同提取溶剂（乙醇和甲醇）对来自土耳其爱琴海地区不同生产者的55份特级初榨橄榄油样品中抗氧化和氧化应激参数的影响。在此背景下，研究人员测定了两种提取物中的DPPH自由基清除活性、总酚含量（TPC）、总抗氧化状态（TAS）、总氧化状态（TOS）和氧化应激指数（OSI）。乙醇提取物显示出更高的TPC和DPPH自由基清除活性，乙醇和甲醇提取物的平均DPPH值分别为24.48%和15.42%。类似地，TOS和OSI值在乙醇提取物中更高，而TAS值在甲醇提取物中更高。相关性分析揭示了抗氧化参数（TPC和TAS）与OSI之间存在显著的负相关关系，表明抗氧化能力与氧化应激之间呈负相关。主成分分析（PCA）显示了抗氧化变量与氧化变量之间的明显分离。Bland–Altman分析进一步确认了提取方法之间的系统性差异。总体而言，研究结果表明提取溶剂是测定橄榄油抗氧化和氧化应激参数的关键因素。乙醇提供更高的酚含量和自由基清除活性，而甲醇在评估总抗氧化能力方面似乎更有效。样品之间的变异性反映了生产、加工和储存条件的差异。

特级初榨橄榄油（EVOO)作为地中海饮食的核心组分，因其富含有益健康的单不饱和脂肪酸（主要是油酸）以及酚类化合物（如羟基酪醇、橄榄苦苷）、生育酚、植物甾醇、类胡萝卜素和叶绿素等微量生物活性成分而备受关注。已有大量研究证实总酚含量（TPC）与EVOO抗氧化潜力之间存在显著正相关，酚类化合物通过自由基清除、氢原子转移和金属螯合等机制提供氧化保护。然而，在评价橄榄油抗氧化与氧化应激参数时，提取溶剂的选择——尤其是乙醇与甲醇——对测定结果的影响尚缺乏系统研究。现有文献表明，溶剂极性、溶剂-基质相互作用及氢键机制显著影响酚类化合物的提取效率和抗氧化活性，但不同溶剂在总抗氧化状态（TAS）、总氧化状态（TOS）及氧化应激指数（OSI）等综合指标上的具体差异仍不清楚。为此，研究人员设计了本研究，旨在评估乙醇和甲醇两种提取溶剂对来自土耳其爱琴海地区55份商品特级初榨橄榄油样品的抗氧化指标（TPC、DPPH自由基清除活性〈DPPH RSA〉、TAS）和氧化相关参数（TOS、OSI）的影响，并运用多变量统计方法揭示参数间关系及溶剂选择对样品氧化-抗氧化特征的影响。论文发表在《Foods》期刊。

研究人员获取了来自土耳其爱琴海地区不同生产者的55份特级初榨橄榄油样品，这些样品随机选自市售产品并在原包装避光保存。主要采用以下关键技术方法：使用80:20（v/v）醇/水体系分别制备甲醇和乙醇提取物，先用正己烷脱脂后离心分离极性相；采用Folin–Ciocalteu比色法测定TPC，结果以没食子酸当量（mg GAE/kg）表示；采用DPPH法测定自由基清除活性（DPPH RSA%）；使用商业试剂盒（Rel Assay Diagnostics）通过自动生化分析仪测定TAS和TOS，结果分别以Trolox当量（mmol TE/kg）和过氧化氢当量（μmol H₂O₂ eq/kg）表示；依据TOS/TAS比值计算OSI。统计方法包括Shapiro-Wilk正态性检验、Wilcoxon符号秩检验、Spearman相关分析、主成分分析（PCA）、Bland-Altman分析及雷达图可视化，多重比较采用Benjamini-Hochberg虚假发现率（FDR）和Bonferroni校正。

**总酚含量（TPC）与DPPH自由基清除活性（DPPH RSA）**：乙醇提取物的TPC均值（138.1 mg GAE/kg）高于甲醇提取物（123.0 mg GAE/kg），乙醇提取物的DPPH RSA均值（24.48%）亦显著高于甲醇提取物（15.42%），表明乙醇在提取酚类及自由基清除活性成分方面效率更高。**总抗氧化状态（TAS）与总氧化状态（TOS）**：甲醇提取物的TAS均值（3.2 mmol TE/kg）高于乙醇提取物（2.8 mmol TE/kg），而乙醇提取物的TOS均值（84.6 μmol H₂O₂ Eq/kg）及OSI均值（3.51）均高于甲醇提取物（TOS 70.5 μmol H₂O₂ Eq/kg，OSI 2.51），提示甲醇在提取总抗氧化成分方面更有效，而乙醇可同时提取更多氧化相关物质。**相关性分析**：Spearman相关显示抗氧化参数（TPC、TAS）与OSI呈负相关，与DPPH RSA呈正相关；TOS与OSI呈强正相关。不同溶剂间TPC（r=0.735）、TOS（r=0.706）和OSI（r=0.807）呈现高度正相关。**配对比较与差异检验**：基于中位数的百分比变化计算表明，与甲醇相比，乙醇使TPC增加17.97%、DPPH RSA增加37.25%、TOS增加40.62%、OSI增加43.87%，而TAS降低4.01%（即甲醇使TAS略高）。Wilcoxon符号秩检验经FDR校正后所有参数均显著，Bonferroni校正后DPPH RSA、TOS和OSI仍显著（p≤0.001），TPC和TAS未达显著（p>0.05）。**Bland-Altman分析**：TPC、DPPH RSA、TOS和OSI显示负偏倚（乙醇较高），TAS显示小幅正偏倚（0.37），多数数据点位于95%一致性区间内，未发现比例偏倚。**主成分分析（PCA）**：前两个主成分（PC1和PC2）解释总方差76.9%（PC1 47.2%，PC2 29.7%）。PC1中OSI（载荷0.547）与TPC（-0.491）和TAS（-0.487）形成对比，PC2中TOS（0.600）和DPPH RSA（0.475）贡献较大。得分图显示乙醇与甲醇提取物沿PC1方向呈现分离趋势，抗氧化与氧化参数在轴向上对立分布。**雷达图**：归一化数据直观显示乙醇提取物在TPC、DPPH RSA、TOS和OSI上高于甲醇，而甲醇仅在TAS上略高。

讨论部分总结：研究人员指出溶剂极性和溶剂-基质相互作用是导致不同提取物参数差异的关键因素，乙醇对中等极性酚类化合物提取更有效，甲醇则更利于提取低分子量酚类。TPC与TAS的正相关证实酚类为总抗氧化能力的主要贡献者，TPC与DPPH RSA的正相关支持酚类在自由基清除中的作用。TAS在甲醇提取物中相对较高可能与甲醇对极性抗氧化化合物的选择性提取有关，而乙醇提取物中TOS和OSI更高表明该溶剂同时提取了更多氧化前体物质。PCA和雷达图进一步凸显了溶剂对整体生化谱的决定性影响。研究人员强调，由于本研究未鉴定单一酚类化合物，故无法确定具体差异成分，且仅评估了两种醇-水系统，结论不可直接外推至其他溶剂。

研究结论翻译：本研究的发现表明，橄榄油的抗氧化和氧化应激谱不仅受样品内在特性强烈影响，也受提取方法的强烈影响。这凸显了在橄榄油质量评估中标准化分析程序的重要性，并强调需要同时评估多个参数以获得对抗氧化能力的准确解释。