《Foods》：Modeling and Optimization of Lactobacillus sakei Application and Vacuum Tumbling for Improving Functional and Technological Properties of Cull Cow Beef
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摘要：淘汰母牛(cull cow)肉因嫩度差、加工适用性低而受限，微生物发酵剂与机械处理的联合效应尚缺乏系统研究。本研究旨在评估在腌制液中添加植物乳杆菌(Lactobacillus sakei，SafePro B?2，1011CFU/g)并结合真空按摩(vac
摘要：淘汰母牛(cull cow)肉因嫩度差、加工适用性低而受限，微生物发酵剂与机械处理的联合效应尚缺乏系统研究。本研究旨在评估在腌制液中添加植物乳杆菌(Lactobacillus sakei，SafePro B?2，1011CFU/g)并结合真空按摩(vacuum massaging)对淘汰母牛肉理化性质、微观结构及功能性—工艺特性(functional–technological properties)的影响，并采用响应面法(response surface methodology, RSM)对工艺进行优化。研究结果显示，与对照组相比，联合处理使剪切力降低25–35%，保水性(water?holding capacity, WHC)提高12–18%；pH由6.2降至5.6–5.8，表明乳酸菌发生活跃产酸发酵。RSM建模显示模型具有较高预测能力(R2= 0.91–0.96)，并确定最优工艺参数为L. sakei 107CFU/g、滚揉时间40 min，可确保最大嫩化效果与产品稳定性。质地剖面分析(texture profile analysis, TPA)表明硬度(hardness)、黏附性(adhesiveness)、咀嚼性(chewiness)显著降低(p < 0.05)，而内聚性(cohesiveness)升高，提示蛋白基质发生微观重组。此外，观察到微观结构改变及蛋白基质重排，伴随氨基酸组成变化，反映肉基质中蛋白质状态及空间分布发生改变。综上，L. sakei与真空滚揉联用可有效改善低等级牛肉原料的功能性、工艺性及结构特征，该策略可为淘汰母牛牛肉加工参数优化及资源高效利用提供科学依据。
论文解读：植物乳杆菌(Lactobacillus sakei)接种联合真空滚揉改善淘汰母牛肉功能性与工艺特性的建模与优化
本研究发表于《Foods》。淘汰母牛(culled cow / cull cow)肉因动物年龄增长导致结缔组织胶原交联增多、肌原纤维蛋白内源性蛋白酶系统活性下降，成熟过程中肌原纤维弱化受限，表现为剪切力高、嫩度差、保水性(water?holding capacity, WHC)低，属于低等级加工原料。现有嫩化技术包括机械滚揉(massaging/tumbling)、腌渍、酶嫩化及乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)发酵剂应用，但单一方法效果不稳定，且针对淘汰母牛肉的乳酸菌与机械处理协同效应及工艺定量优化模型仍十分欠缺。植物乳杆菌(Lactobacillus sakei, L. sakei)是肉制品中常用的起始发酵菌，具蛋白修饰潜能；真空滚揉可促进腌液分布、肌原纤维蛋白溶出及肌纤维结构松散。二者联用可能产生协同增效，但相关研究尚未系统开展。因此，研究人员以淘汰母牛股部肌肉为对象，通过三水平二因素全因子实验，考察L. sakei添加量（按原料质量0.005%、0.010%、0.015%，对应约5×106–1.5×107CFU/g原料肉）与真空滚揉时间（20、40、60 min）对理化指标、色泽、WHC、持水性(water?binding capacity, WBC)、剪切力、质地剖面(texture profile analysis, TPA)、氨基酸组成及微观结构的影响，并建立二阶多项式回归模型，通过多响应满意度函数(desirability function)法进行工艺优化，以明确最佳处理条件并阐释其作用机制。
为开展研究，研究人员采用如下关键技术方法：样本来源于5头6–7岁荷斯坦(Holstein)淘汰母牛臀腿部肌肉(n=5生物学重复)，剔除可见结缔组织与脂肪后切分为0.4 kg肉块；按32全因子设计将L. sakei（SafePro? B?2，1011CFU/g）掺入标准腌制液（盐、蔗糖、亚硝酸钠腌制剂、复合磷酸盐）并以15%原料质量注射，对照组不添加L. sakei且不滚揉；注射后4℃静置18 h使腌液均衡分布，随后于真空滚揉机中以20 rpm按设定时间处理；测定指标包括pH（穿刺电极法）、色泽（Lab*，D65光源，30 min肌红蛋白氧合稳定后测表面）、基本成分（粗蛋白凯氏定氮法、粗脂肪正己烷提取法、灰分550℃灼烧法）、WHC（Grau?Hamm压滤法）、WBC（离心法）、剪切力与TPA（质构仪垂直肌纤维穿刺）、氨基酸组成（酸水解?HPLC柱前衍生荧光检测）、微观结构（光学显微镜?数字成像?ImageFocus软件形态计量分析Feret直径与投影面积）；以STATISTICA 13拟合二阶多项式回归模型并进行方差分析(ANOVA)、Durbin?Watson检验及VIF多重共线性诊断，采用Derringer?Suich多响应满意度函数确定最优工艺参数，组间差异用SPSS单因素ANOVA及Duncan多重比较(p < 0.05)。
3.1. Experimental Design and Results of the Full Factorial Experiment（全因子实验设计与结果）
通过32全因子实验采集WHC(Y1)、WBC(Y2)、剪切力(Y3)数据，与未处理对照相比，处理组WHC与WBC升高、剪切力降低，提示L. sakei代谢与滚揉机械作用共同修饰肌原纤维蛋白基质空间组织及水合状态；描述性统计显示各响应变量变异系数低(1.23%–7.79%)，均值与中位数接近，数据适合回归建模。
3.2. Development and Statistical Evaluation of Quadratic Regression Models（二次回归模型建立与统计评价）
分别以WHC、WBC、剪切力为因变量拟合含线性项、二次项及交互项的二阶多项式模型。WHC模型中线性项、二次项及交互项均显著(p < 0.05)，呈明显非线性响应面；WBC模型中仅线性项显著，响应以主效应为主；剪切力模型中线性项与交互项显著，二次项不显著。VIF=1.0表明无多重共线性。所得回归方程R2分别为0.999、0.987、0.996，F检验显著(p < 0.05)，Durbin?Watson统计量(d=1.70–1.83)提示残差无自相关，模型在实验域内具良好拟合与预测能力。验证点计算值与实测值偏差≤0.3%，证实模型可靠性。
3.3. Response Surface Analysis and Multi-Response Optimization（响应面分析与多响应优化）
WHC响应面在L. sakei 0.010%–0.013%、滚揉40–50 min出现局部最适区，沿L. sakei轴梯度更陡，过高因子水平因负二次项趋于平台；WBC随两因子增大单调缓升，无明显极值，主要靠主效应累积；剪切力随两因子增大单调下降，L. sakei影响大于滚揉时间，在实验域上限附近最低。经多响应满意度函数优化（WHC与WBC最大化、剪切力最小化），确定最优工艺为L. sakei 0.010%（约107CFU/g原料肉）配合真空滚揉40 min，此时WHC接近局部极大、WBC维持高位、剪切力显著低于对照，属三者最佳折衷方案。该点恰为实验设计点之一，预测值与实测值吻合良好，属模型内验证。
3.4. Physicochemical Properties（理化基本成分）
蛋白含量各组间无显著差异(p > 0.05)，说明L. sakei不改变总蛋白质量分数，仅改变其功能状态。脂肪质量分数由对照3.51%降至0.015%组的2.87%，提示菌体与滚揉可能影响脂?蛋白相互作用或相分布。灰分由0.93%略降至0.83%（高剂量组），可能源于基质重排影响矿物质保留。水分由73.13%降至70.83%，结合WHC上升，表明自由水向结合水转化，蛋白?水基质压实、水合模式改变，且该效应呈剂量依赖性。
3.5. Amino Acid Content（氨基酸组成）
与对照比，添加L. sakei后多数氨基酸含量升高，尤以谷氨酰胺(glutamine)、组氨酸(histidine)、赖氨酸(lysine)、异亮氨酸(isoleucine)明显，亮氨酸(leucine)略有下降，支链氨基酸(branched?chain amino acids, BCAA)内部发生再分配。提示L. sakei在滚揉辅助下激活轻度蛋白水解及选择性游离氨基酸积累，引起氨基酸谱向营养更优方向偏移，属早期基质蛋白转化结果。
3.6. pH and Instrumental Color Characteristics（pH与仪器测定色泽）
对照pH 6.06±0.10；0.005%与0.010% L. sakei组pH升至6.42与6.61(p < 0.05)，0.015%组pH显著降至5.62±0.09，说明L. sakei代谢产酸具明显剂量阈值——低中剂量未致酸化甚至微碱偏移，高剂量引发典型乳酸发酵酸化。L（亮度）随L. sakei增加而降低(50.29→39.58)，样品变暗；a（红度）升高(15.01→20.89)，呈更鲜明红色，且无额外色素或护色剂添加，推测与菌体代谢影响肌红蛋白稳定性及基质光散射特性有关；b*（黄度）无显著变化。
3.7. Texture Profile Analysis（质地剖面分析TPA）
硬度：对照12.95 N，0.005%组略升至13.58 N(p < 0.05)，0.010%组与对照无差异，0.015%组大幅降至5.92 N(p < 0.05)，呈非线性剂量效应——低剂量微增强结构完整性，高剂量联合滚揉致基质明显弱化。内聚性(cohesiveness)由0.31升至0.46(p < 0.05)，反映肌原纤维蛋白溶出并增强结构单元间结合，形成较柔软但内聚性更高的网络。弹性(springiness)在0.005%最高(0.62)，0.015%降至0.41，表明高剂量与机械作用削弱形变恢复能力。胶黏性(gumminess)由4.09 N降至2.69 N，咀嚼性(chewiness)由2.43 N·cm降至1.11 N·cm，回弹性(resilience)由0.18降至0.12，均与蛋白网络降解及水合增强相符，综合表明L. sakei+真空滚揉可有针对性地调控质地。
3.8. Microstructural Analysis（微观结构分析）
对照肌纤维紧密排列、间距小；0.005% L. sakei组见纤维轻度肿胀、间隙略增，Feret直径达约36.8 μm，投影面积约810 μm2，结构未破坏；0.015%组肌纤维松散、间隙扩大，形成较开放多孔基质，Feret直径约49.3 μm，投影面积约1350 μm2，系L. sakei生化修饰（弱蛋白水解、pH变动）与滚揉机械力协同促使纤维分离及蛋白连续相形成，证实处理可定向重构肌肉微观组织而不改变原料化学组成。
讨论与结论总结（翻译并浓缩Conclusions部分）：
本研究证明，腌制液中添加Lactobacillus sakei并结合真空滚揉可显著改善淘汰母牛肉的理化、结构?机械及功能性?工艺特性。响应面分析确认两因素对保水特性与剪切力影响显著，回归模型具高适定性(R2=0.91–0.96)。联合处理使剪切力较对照降低25–35%，WHC提高12–18%；优化工艺参数为L. sakei 107CFU/g与滚揉40 min，可获得最佳嫩化与产品稳定性组合。TPA显示硬度、黏附性、咀嚼性显著降低(p < 0.05)，内聚性升高，佐证蛋白基质微观重组。效应归因于肌组织微观结构修饰与蛋白基质重排，伴随水分重新分布及蛋白质水合位点可及性增加，并检测到氨基酸组成改变，反映蛋白组分状态转变。本研究创新点在于揭示了L. sakei与真空滚揉的协同(synergistic)效应，阐明微观蛋白基质重排相关机制，所建RSM模型可预测产品特性并优化低等级牛肉加工参数，为提高淘汰母牛肉类资源利用率提供了基于科学实验依据的工艺策略。
