《International Journal of Molecular Sciences》：Reduced Mitochondrial DNA Copy Number and Telomere Length in Essential Tremor Patients: Evidence from an Age- and Sex-Adjusted Cross-Sectional Case–Control Study
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摘要：原发性震颤（Essential tremor, ET）是一种常见运动障碍性疾病，日益被认为是有神经退行性特征的复杂综合征。虽然线粒体功能障碍和细胞衰老参与多种神经退行性疾病，其在ET中的作用尚未被探讨。本研究旨在检测ET患者的线粒体DNA拷贝数（mito
摘要：原发性震颤（Essential tremor, ET）是一种常见运动障碍性疾病，日益被认为是有神经退行性特征的复杂综合征。虽然线粒体功能障碍和细胞衰老参与多种神经退行性疾病，其在ET中的作用尚未被探讨。本研究旨在检测ET患者的线粒体DNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number, mtDNA-CN）及端粒长度（telomere length, TL），并评估其作为线粒体功能障碍和生物衰老标志物的潜能。本横断面病例对照研究纳入68例ET患者（中位年龄66岁；64.7%男性）和62名健康对照（中位年龄70岁；54.8%男性）。采用实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）检测相对mtDNA-CN（以线粒体ND1基因水平表示）和TL（端粒与单拷贝基因比值，T/S ratio），均以内参β-肌动蛋白（β-actin）标准化。采用年龄和性别校正的多元线性回归分析log2转换后数据与疾病状态的关系，统计学显著性定义为经错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正Wald检验p < 0.05。行受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线分析及效应量（Cohen's d）分析。结果显示，ET患者mtDNA-CN（β = ?2.785，95% CI ?3.700～?1.869；pFDR= 2.53 × 10?9）和TL（β = ?2.073，95% CI ?2.758～?1.388；pFDR= 3.00 × 10?9）均显著降低，分别对应约6.9倍和4.2倍的降低。年龄及性别分层分析证实降低具有一致性，在老年个体中更显著。两标志物均具良好判别效能（mtDNA-CN：AUC = 0.83，95% CI 0.75～0.90；TL：AUC = 0.76，95% CI 0.68～0.85）及大效应量（Cohen's d = |1.192|和|1.058|）。mtDNA-CN及TL降低支持ET中存在线粒体功能受损及加速的细胞衰老，可能作为可及的外周血生物标志物，并为未来纵向及机制研究提供基础。
《International Journal of Molecular Sciences》刊载的此项研究针对原发性震颤（Essential tremor, ET）是否被线粒体功能障碍及加速细胞衰老参与这一尚未明确的问题展开。ET传统被视为良性孤立性震颤，近年临床及病理证据表明其具神经退行性及多系统特征，且与帕金森病（Parkinson's disease, PD）有部分重叠易感通路，提示可能存在共同生物学机制。线粒体DNA拷贝数（mitochondrial DNA copy number, mtDNA-CN）是线粒体生物能产能力的替代指标，端粒长度（telomere length, TL）是细胞衰老及氧化应激累积的标志，二者在其他神经退行性疾病中有报道但从未在ET外周血中系统评估。研究人员假设ET患者外周血mtDNA-CN及TL低于健康对照，可反映全身线粒体功能障碍与加速生物衰老，并具有判别价值。
主要关键技术方法： 研究人员于意大利卡坦扎罗大学大希腊校区神经科学研究中心招募68例符合国际帕金森及运动障碍学会（International Parkinson and Movement Disorder Society, IPMDS）共识诊断标准的ET患者（震颤≥3年、双侧上肢动作性震颤，排除肌张力障碍、共济失调、帕金森征等）及62名健康对照（排除神经疾病史、ET家族史及抗惊厥药使用）。提取全血基因组DNA，采用SYBR Green实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）分别扩增线粒体ND1基因（mtDNA）及端粒重复序列，均以单拷贝内参基因β-actin（ACTB）标准化，计算相对mtDNA-CN（ΔΔCt法）及TL（T/S比值）。数据经log2转换后用含年龄、性别协变量的多元线性回归结合HC3异方差稳健标准误分析，FDR校正；进行ROC曲线、Cohen's d效应量、Spearman相关性及分层（年龄、性别）分析。
2.1. Subjects（研究对象）： 研究最终纳入130人（ET组68例，中位年龄66岁，64.7%男性；健康对照HC组62例，中位年龄70岁，54.8%男性），两组性别分布无差异（p = 0.3332），年龄有差异（p = 0.0086），分析中予以校正。所有受试者签署知情同意，研究经卡拉布里亚大区伦理委员会审批（编号143，2024年5月13日）。
2.2. Assay Reproducibility and Statistical Validation（检测重复性与统计验证）： ND1、β-actin及端粒测定的批内变异系数（Coefficient of Variation, CV）分别为0.97%、0.75%及1.53%，表明分析精密度高。mtDNA-CN及TL原始数据不符合正态分布（Shapiro–Wilk p < 0.001），且存在异方差（Breusch–Pagan检验 p = 0.039及0.007），故推断基于log2转换数据并使用HC3稳健标准误。效能分析显示ET vs HC比较可检出中等以上效应量（80%效能下最小检出Cohen's d = 0.496）。
2.3. Reduced mtDNA-CN and TL in Essential Tremor Patients（ET患者mtDNA-CN及TL降低）： 年龄性别校正线性回归显示ET状态独立关联更低log2mtDNA-CN（β = ?2.785，95% CI ?3.700～?1.869，p < 0.001），模型解释28.3%变异（R2= 0.283），Cohen's d = |1.192|，仅8.8% ET值落入HC四分位距内；模型校正值示ET相对定量（Relative Quantification, RQ）为HC的0.145，即mtDNA-CN约降低6.9倍。同样，ET独立关联更低log2TL（β = ?2.073，95% CI ?2.758～?1.388，p < 0.001），R2= 0.226，Cohen's d = |1.058|，39.7% ET值落HC四分位距内；RQ = 0.238，即TL约降低4.2倍。结论：ET患者外周血mtDNA-CN及TL均显著低于健康对照。
2.4. Association Analyses and Diagnostic Accuracy（关联分析与诊断准确度）： 多变量模型中年龄及性别均不独立预测mtDNA-CN或TL（p > 0.05）。ROC分析示mtDNA-CN判别ET与HC的AUC = 0.83（95% CI 0.75～0.90），TL的AUC = 0.76（95% CI 0.68～0.85）；mtDNA-CN判别性能优于TL但差异未达显著（DeLong检验 p = 0.153）。结论：两标志物均高于随机判别水平，mtDNA-CN具较好诊断潜能。
2.5. Age- and Sex-Specific Differences in mtDNA-CN and Telomere Length（mtDNA-CN及TL的年龄与性别特异性差异）： 年龄分层显示58～63岁亚组ET与HC的mtDNA-CN及TL差异无统计学意义；64～69岁亚组仅mtDNA-CN显著降低；70～75岁及76～81岁亚组mtDNA-CN与TL均显著降低，且效应量更大（mtDNA-CN Cohen's d最高?2.23，TL最高?1.02），统计效能充足（≥0.89）。性别分层示女性ET mtDNA-CN及TL均显著低于女性HC（FDR p < 0.01，d = ?0.89及?0.82）；男性ET降低更显著（FDR p < 0.001，d = ?1.36及?1.27）。结论：降低存在于两性，男性和高龄者更明显。
2.6. Correlation Between mtDNA-CN and TL（mtDNA-CN与TL的相关性）： 总体队列mtDNA-CN与TL呈显著正相关（Spearman ρ = 0.608，p = 1.78×10?14）；HC中ρ = 0.737（p = 8.78×10?12），ET中ρ = 0.365（p = 0.002）。调整年龄、性别、疾病分组后总体仍正相关（β = 0.510，95% CI 0.313～0.708，p = 3.93×10?7），HC中亦显著（β = 0.529，p = 2.21×10?6），ET中为正但不显著（β = 0.319，95% CI ?0.141～0.780，p = 0.174）；交互项不显著（p = 0.310）。结论：mtDNA-CN与TL在正常人中强相关，ET中关联减弱但未证实组间差异有统计学意义。
讨论部分总结： 研究人员指出ET患者外周血mtDNA-CN降低提示存在系统性线粒体改变，可能涉及线粒体生物合成受损及氧化应激增加，与ET小脑浦肯野细胞易损性病理相符；TL缩短反映细胞衰老及氧化应激累积，线粒体功能障碍与端粒损耗可经氧化应激形成双向负反馈环路，二者并行降低具生物学合理性。年龄分层中高龄者差异更显著，需注意全血mtDNA-CN受随龄下降的血小板计数影响，但也可能叠加疾病持续时间相关的累积线粒体改变；性别分层两性别均降低，男性效应略大，需更大样本验证。局限性包括全血不能等同中枢神经元动态、未系统控制用药及代谢炎症因素、mtDNA-CN为比值且受白细胞组分影响致倍数变化须谨慎解读、单中心意大利人群样本量有限，需独立大样本及分选白细胞验证。
结论（翻译）： 综上所述，本研究表明原发性震颤患者全血线粒体DNA拷贝数及端粒长度较健康对照显著降低。各分析中观察到的一致改变及其判别效能提示，mtDNA-CN和TL可作为反映ET疾病相关生物学改变的可及性外周生物标志物。
