《Polymers》：Methodological Insights from Low-Vacuum SEM for Morphological Analysis of Schwann Cells on Electrospun Scaffolds
编辑推荐：
施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经再生的关键效应细胞，其与生物材料支架的相互作用是神经组织工程中的一个关键参数。这项初步研究描述并评估了利用低真空条件下可变压力扫描电子显微镜（variable-pressure scanning ele
施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经再生的关键效应细胞，其与生物材料支架的相互作用是神经组织工程中的一个关键参数。这项初步研究描述并评估了利用低真空条件下可变压力扫描电子显微镜（variable-pressure scanning electron microscopy, VP-SEM）对种植在静电纺丝聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）支架上的SCs进行形态学、定量和形态计量分析的方案，无需金属镀层。研究人员比较了六种方案，改变了种植细胞数量（50,000或100,000）以及标记支架种植面的方法：无标记、石墨铅笔或永久性墨水（Sharpie）。共聚焦显微镜证实了SCs的活力和粘附性。VP-SEM分析显示，种植100,000个细胞显著增加了支架表面可检测到的细胞数量。石墨标记与更高的细胞计数和更星形的形态相关，这与文献中报道的碳基材料的生物相容性一致。相反，墨水标记似乎抑制了SCs的粘附。研究人员还建立了一个使用ImageJ的ROI Manager和分段线工具测量SC细胞突起的精细化方案。这些发现提供了实用的方法学见解，以提高超薄聚合物支架上SC形态学分析的可靠性和可重复性，对周围神经再生研究具有启示意义。
**论文解读：低真空扫描电子显微镜用于静电纺丝支架上施万细胞形态学分析的方法学见解**
**1. 研究背景、问题及意义**
施万细胞（Schwann cells, SCs）是周围神经系统的主要胶质细胞，在轴突支持、髓鞘形成和周围神经微环境维持中发挥关键作用。神经损伤后，SCs可重编程为修复表型，通过引导轴突再生的Büngner带等机制参与神经再生。因此，SCs与生物材料支架的相互作用是神经组织工程的核心参数。扫描电子显微镜（scanning electron microscopy, SEM）能够高分辨率观察生物材料表面形貌、细胞形态和细胞-材料界面，但其分析价值高度依赖于样品制备方案，固定、脱水等过程可能引起皱缩、结构塌陷和充电伪影。超薄聚合物支架（如静电纺丝聚羟基丁酸酯（polyhydroxybutyrate, PHB）支架）因其纳米尺寸、高孔隙率和低刚性，在培养和处理过程中容易翻转，导致难以准确识别种植面，从而造成方法学偏差。现有研究大多采用金属镀层SEM，可能掩盖细胞与纤维相互作用的细节，且缺乏对种植面标记策略的系统比较。因此，本研究旨在探讨低真空可变压力扫描电子显微镜（variable-pressure scanning electron microscopy, VP-SEM）下，不同细胞种植数量和种植面标记方法对SCs形态学分析的影响，建立优化方案以提高分析的可靠性和可重复性。该论文发表在《Polymers》。
**2. 主要关键技术方法**
研究采用了以下关键技术方法：①静电纺丝技术制备PHB支架（10% PHB溶于氯仿，电压25 kV，流速1 mL/h，收集距离15 cm，转速50 rpm，时间150 min），裁剪为直径5 mm圆形样品；②细胞培养与种植：使用商业SCs（SCL 4.1/F7，ECACC来源），在Ham's F-12培养基（含1%谷氨酰胺、10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum, FBS）、1%青霉素-链霉素）中培养至70%融合后，以50,000或100,000个细胞种植于PHB支架；③种植面标记方法：无标记（对照）、石墨铅笔标记或Sharpie墨水标记；④低真空VP-SEM（Hitachi SU3500）成像，不使用金属镀层，固定于2.5%戊二醛；⑤ImageJ软件进行细胞计数（多点工具）和细胞突起长度测量（分段线工具结合ROI Manager）；⑥共聚焦显微镜（Olympus FV1000）对同一样品进行后续分析（DAPI和Fastgreen染色）。研究未提及样本队列来源，但细胞系购自Merck-Sigma。
**3. 研究结果**
**3.1 VP-SEM形态学分析**
- **Control 50和Control 100方案**：VP-SEM图像显示SCs粘附于PHB纤维，细胞呈扁平形状。Control 100组观察到更多细胞和更明显的细胞突起。
- **Graphite 50和Graphite 100方案**：细胞呈星形，与PHB纤维交织。Graphite 100组细胞数量多于Graphite 50组，但Graphite 50组细胞突起更明显。
- **Ink 50和Ink 100方案**：细胞粘附较少。Ink 50组观察到小的电子致密结构（可能为墨水残留），细胞稀疏；Ink 100组细胞数量略多但呈扁平形态。
**3.2 细胞数量量化**
通过VP-SEM图像计数，数据呈正态分布，经单因素方差分析（ANOVA）和Bonferroni事后检验。Control 100（12.7±5.2个）和Graphite 100（28.3±6.3个）组细胞数量显著高于各自的50,000组（p<0.05）。Graphite 100组细胞数量显著高于所有其他组（p<0.001）。Ink标记组（Ink 50: 2.2±1.2个；Ink 100: 4.7±2.6个）未显示种植数量间的显著差异。
**3.3 施万细胞突起测量**
细胞突起长度数据不呈正态分布，采用Kruskal-Wallis检验和Dun's事后检验。Graphite 50和Ink 100组的突起长度显著长于其他组（p<0.05），而Control 50、Control 100、Graphite 100和Ink 50组之间无显著差异。结果提示，当细胞数量较少时，细胞可能延伸更长的突起以连接远处细胞。
**3.4 VP-SEM分析后的共聚焦显微镜分析**
对VP-SEM分析后的同一批样品进行共聚焦显微镜成像，证实了SCs与PHB支架的粘附和存活，表明同一样品可进行多模式显微分析。
**4. 讨论总结与结论翻译**
讨论部分指出，本研究的方法学贡献包括：采用未镀层的低真空VP-SEM，保留了细胞-纤维界面的精细细节；系统比较了种植面标记策略，解决了超薄膜样品翻转带来的偏差；利用ImageJ的“分段线”和“ROI Manager”工具实现了细胞突起的精确测量；同一标本先后进行VP-SEM和共聚焦显微镜分析展示了多模式表征的可行性。与先前使用金、金-钯等镀层SEM的研究相比，未镀层VP-SEM能揭示更细致的细胞相互作用。石墨标记与更高的细胞计数和星形形态相关，与碳基材料（如石墨烯、多壁碳纳米管）对SCs的积极效应一致，而墨水标记似乎抑制SCs粘附。细胞突起测量结果显示，检测到细胞较少的组（Graphite 50、Ink 100）具有更长的突起，可能反映细胞网络构建行为，但需进一步功能验证。该方案的主要优势在于样品制备简单，主要挑战包括样品翻转导致的种植面混淆以及细胞突起与PHB纤维形态相似导致的测量困难。研究的局限性在于未纳入细胞增殖/活力和迁移分析方法，导致结果主要为描述性。
研究结论部分翻译如下：“本初步研究提供了使用可变压力扫描电子显微镜（VP-SEM）与传统需要样品镀层的扫描电子显微镜（SEM）相比，关于施万细胞与静电纺丝聚合物支架相互作用样品制备和形态学分析的注意事项的见解。初步描述性结果表明，种植更多数量的细胞可提高在静电纺丝聚合物支架上成功定位和分析的可能性。此外，标记细胞种植面是一种减少SEM形态学分析中混淆风险的方法学考虑。分析SC细胞突起至关重要，因为它在使用所述方法时提供了细胞行为的有价值见解。本研究中提出的分析和讨论是初步且主要为描述性的；鼓励未来进行建设性讨论以进一步完善种植在聚合物支架上SCs的形态学分析，例如通过适当的细胞增殖和活力方法进行细胞定量的功能确认。这项工作是为更复杂和精细分析迈出的第一步，将有助于更深入理解SCs行为及其在周围神经再生中的应用。”
