《Membranes》：Separation of Monoclonal Antibody Aggregates Using an Analytical Ultrafiltration Technique
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体积排阻色谱（SEC）是测定单克隆抗体样品中聚集体含量的行业标准方法。本文提出了一种基于超滤（ultrafiltration）的正交分析技术，用于检测和定量单克隆抗体聚集体。待分析样品在超滤模式下进样，单体单克隆抗体分子以透过液峰的形式被检测。随后系统切换至反
体积排阻色谱（SEC）是测定单克隆抗体样品中聚集体含量的行业标准方法。本文提出了一种基于超滤（ultrafiltration）的正交分析技术，用于检测和定量单克隆抗体聚集体。待分析样品在超滤模式下进样，单体单克隆抗体分子以透过液峰的形式被检测。随后系统切换至反向流模式，聚集体被回收并以截留组分峰的形式检测。特定样品中的聚集体含量基于相对峰面积进行定量，类似于液相色谱中的定量方式。本研究采用所提出的分析型超滤技术检测了两种单克隆抗体。体积排阻色谱（SEC）作为对照技术。结果表明，两种技术获得的数据具有良好一致性。文中进一步讨论了所提出分析型超滤技术的优势与局限性。
本文发表于《Membranes》，研究聚焦于单克隆抗体（mAb，单一B细胞克隆产生的抗体）制剂中聚集体的分离与定量分析问题。单克隆抗体已广泛用于治疗和诊断，但其作为结构复杂的大分子蛋白，容易发生变性、断裂、聚集以及氧化、脱酰胺、糖基化等化学修饰。其中，聚集是最常见且最受关注的质量风险之一，因为聚集体通常会降低治疗活性，并与毒性和免疫原性升高相关。因此，建立灵敏、可靠且适用于常规分析的聚集体检测方法，对于保障单克隆抗体药物的安全性和有效性具有重要意义。
目前，体积排阻色谱（SEC）被公认为单克隆抗体聚集体分析的标准方法，但该方法存在若干关键局限。其一，样品中的蛋白，尤其是聚集体，可能与色谱固定相或色谱系统硬件表面发生非特异性静电相互作用或疏水相互作用，导致回收不完全，从而低估聚集体含量。其二，单体与二聚体峰在某些情况下不能实现基线分离，造成峰积分和结果解释的主观性。其三，SEC对不溶性聚集体的检测能力有限。已有研究因此常联合沉降速度分析超速离心（SV-AUC）和非对称场流分离（AFFF）等正交方法，以补充SEC信息。然而，这些方法在设备复杂度、分析效率或方法适用性方面仍存在现实限制。基于上述问题，研究人员提出一种分析型超滤（AUF）方法，旨在构建一种与SEC互补、能够快速测定单克隆抗体总聚集体含量的新型分析技术。
研究人员建立的AUF技术来源于载体相超滤与反向流回收（CPUFBR）技术的小型化和分析化改造版本。该方法的核心思想是：利用带有100 kDa分子量截留值（MWCO）的超滤膜，使单体mAb透过膜而聚集体被截留。系统与液相色谱平台联用，通过四通两位阀控制流路切换。样品先在超滤模式下注入，单体以透过峰形式被紫外检测器记录；当单体透过完成后，再切换到反向流回收模式，将膜上截留的聚集体洗脱并形成第二个峰，即截留组分峰。随后，研究人员根据两个峰的相对峰面积计算样品中聚集体比例，从而实现类似液相色谱积分定量的分析目的。研究选取了两种单克隆抗体样品：一种为经反复冻融诱导形成较高聚集体水平的Trastuzumab（mAb1），另一种为低聚集体水平的hIgG1-CD4（mAb2）。SEC被用作对照方法，以评估AUF结果的准确性与可比性。
研究采用的主要技术方法包括以下几个方面。首先，使用分析型SEC对两种mAb样品进行对照分析，以获得标准聚集体含量数据。其次，自主设计并构建低死体积超滤膜模块，将其集成至AKTA Prime Plus液相系统中，通过280 nm紫外吸收信号记录AUF分离图谱。再次，采用空白PBS样品进行方法学干扰评估，以判断阀切换和流向逆转是否引入伪峰。最后，对mAb1与mAb2分别进行5次重复AUF实验，并与SEC测得的聚集体比例进行比较，以验证方法稳定性与结果一致性。样品来源包括自制的Trastuzumab和由Oxford University Therapeutic Antibody Centre提供的hIgG1-CD4。
在结果部分，论文首先报告了SEC对两种单克隆抗体的分析结果。通过分子量校准进行峰识别后，mAb1样品的聚集体含量为8.60%，mAb2样品的聚集体含量为2.05%。根据保留时间推断，mAb1中的聚集体主要为较高阶聚集体，例如三聚体或四聚体，且出现在SEC柱的空隙体积分级中；而mAb2中的聚集体则主要为二聚体。这部分结果建立了后续AUF方法评价的对照基础。
在“空白实验”部分，研究人员先向AUF系统注入10 μL PBS（pH 7.4），在0.5 mL/min流速下实施超滤和反向流回收，并在4 mL时启动反向流。结果显示，超滤阶段的紫外吸收基线稳定，没有明显漂移；在切换至反向流回收时虽出现微小信号扰动，但仅形成面积极小的微弱峰。研究人员据此认为，该装置切换过程引发的实验伪影极小，不足以显著影响后续聚集体分析结果。这一实验为AUF定量结果的可信度提供了方法学支撑。
在“mAb1的分析型超滤分析”部分，AUF图谱中出现两个清晰分离的峰：第一个为可透过组分峰，对应mAb单体；第二个为截留组分峰，对应mAb聚集体。研究人员在5次重复实验基础上对峰面积进行积分，并据此计算mAb1聚集体含量。结果与SEC所得数据吻合良好，说明AUF能够有效识别并定量高聚集体样品中的聚集组分。该结果支持了100 kDa MWCO膜在所设定体积透过通量条件下允许单体透过而保留聚集体的工作假设。
在“mAb2的分析型超滤分析”部分，研究人员采用与mAb1相同的实验流程和操作参数分析低聚集体样品mAb2。结果同样获得两个分离良好的峰，但截留组分峰明显小于mAb1，符合mAb2聚集体含量较低的预期。5次重复实验所得平均聚集体含量与SEC分析值也表现出良好一致性。这表明AUF不仅适用于高聚集体含量样品，也能用于较低聚集体水平样品的稳定检测，具有一定的通用性。
在“方法性能与意义”部分，研究指出AUF获得的单体峰与聚集体峰分离良好，峰面积积分较为直接，且基线稳定。与SEC相比，AUF可以通过调节反向流回收启动体积来控制两峰分离程度，从而降低积分主观性。研究还比较了空白扰动峰与实际聚集体峰的面积：空白实验的平均微扰峰面积仅为0.009 mAu mL，而mAb1和mAb2的截留组分峰平均面积分别为1.034 mAu mL和0.223 mAu mL，进一步证明测得信号主要来源于真实聚集体而非系统切换伪影。
论文进一步总结了AUF的应用潜力与局限性。其优势在于：分析时间约10 min，每次运行载液用量约5 mL，具有较高效率和较低流动相消耗；作为正交技术，可补充SEC对聚集体检测的不足；同时，AUF将所有聚集体汇总为单一复合峰，有助于减少多峰分散和未完全分离带来的积分误差，提高总聚集体含量测量的可靠性；此外，该方法理论上还能覆盖可溶性与不溶性聚集体，因此有潜力用于mAb样品批次放行（batch clearance）的常规聚集体监测。其主要局限在于，所有聚集体被合并检测为一个峰，因此无法区分二聚体、三聚体、四聚体等不同聚集种类的组成比例，不适用于需要解析聚集机制或聚集体组成分布的研究场景。
讨论部分强调，AUF作为一种新型正交分析技术，展示出良好的可行性和实用前景。尽管其无法分辨不同级别聚集体，但正因为聚集组分不再分散于多个峰中，净聚集体含量的测定反而可能较SEC更可靠。研究人员指出，未来可进一步考察该方法是否能够扩展至可溶性与不溶性聚集体的进一步区分，同时还需系统研究溶液条件对蛋白-膜相互作用的影响，以及这类相互作用对AUF分析性能的潜在干扰。总体来看，该研究为单克隆抗体聚集体分析提供了一种结构简洁、检测快速、结果与SEC高度一致的新方法，具有明确的方法学价值和制药分析应用意义。
研究结论部分可概括为：所提出的分析型超滤（AUF）技术适用于测定单克隆抗体样品中的聚集体含量。空白实验表明，该技术获得的聚集体数据不太可能受到实验伪影干扰。通过分析两种聚集体水平不同的单克隆抗体样品，证实了该技术具有良好的适用性。AUF测得的聚集体含量与体积排阻色谱（SEC）结果具有良好一致性，因此该方法有望进一步发展为相对于SEC的正交技术，用于单克隆抗体样品批次放行中的聚集体检测。该技术的主要局限在于将所有聚集体作为单一组分测量，因而不能解析二聚体、三聚体等不同聚集体类型的组成；但也正因如此，不同聚集体不会分散到多个峰中，从而使AUF获得的总聚集体含量测定结果可能比SEC更为可靠。
