《Viruses》：Validation of an In-House High-Throughput Total RNA Sequencing Test for the Detection of Plant Viruses and Viroids
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高通量测序（HTS）正成为植物诊断的首选方法，可在无需预先了解靶标信息的情况下检测已知及新型病毒和类病毒，即使在多重感染中亦能发挥作用。然而，与实时PCR或ELISA相比，该方法存在一定局限性。实验室在内部实施此类技术时，须确保其性能标准满足诊断活动的相关要求
高通量测序（HTS）正成为植物诊断的首选方法，可在无需预先了解靶标信息的情况下检测已知及新型病毒和类病毒，即使在多重感染中亦能发挥作用。然而，与实时PCR或ELISA相比，该方法存在一定局限性。实验室在内部实施此类技术时，须确保其性能标准满足诊断活动的相关要求。本研究中，研究人员介绍了一套基于总RNA提取、核糖体耗竭（ribodepletion）、Illumina测序及生物信息学分析的院内植物病毒与类病毒检测工作流程。以番茄褐色皱果病毒（ToBRFV，RNA基因组）、番茄曲叶新德里病毒（ToLCNDV，DNA基因组）及辣椒小果类病毒（PCFVd，RNA基因组）为对象，评估了分析灵敏度、分析特异性（inclusivity与exclusivity）、选择性、重复性、再现性及稳健性等性能指标。所获性能水平满足有症状植物样本中病毒与类病毒检测的要求。
研究背景与目的方面，病毒在植物中广泛存在，造成重大经济损失并对粮食安全构成威胁。传统诊断技术如生物测定、电子显微镜、血清学及核酸扩增技术逐步演进，高通量测序（HTS）已成为最具前景的检测技术。实时PCR虽为金标准，但需预先知晓靶标序列且每种靶标需单独设计检测方法。HTS通过测序样本中数百万条核酸序列，理论上可检测任何病毒，但实验流程中各步骤的技术选择均会影响检测性能。植物病理学中，HTS检测可分为采样、核酸提取、文库制备、测序、原始读段分析、靶标鉴定、对照分析、靶标确认、结果解读与报告等步骤。尽管已有指南辅助实验室建立可靠的HTS诊断流程，但尚未形成统一共识，各实验室需根据自身目标与技术条件设计工作流程。
在已有研究基础上，研究人员建立了一套基于总RNA提取、核糖体耗竭和Illumina测序的工作流程，用于院内官方控制及新发/新型病毒的检测。该流程通过靶向总RNA，实现对RNA病毒、DNA病毒及类病毒的检测。生物信息学分析基于先前开发的流程优化，整合了蛋白质序列比对的分类学注释以及基于深度学习的新型病毒检测工具。
该研究以发表于《Viruses》的论文为依托，旨在验证该工作流程检测已知及未知RNA病毒、DNA病毒和类病毒的性能，验证对象为ToBRFV（RNA基因组）、ToLCNDV（DNA基因组）和PCFVd（RNA基因组）。
关键技术方法方面，研究样本主要来源于官方控制框架下采集的植物材料，包括新鲜样本（-80°C保存）和冻干样本。实验采用RNA Plant Mini Kit进行总RNA提取，使用QIAseq Stranded RNA Library Enzyme kit及QIAseq FastSelect rRNA Plant kit进行文库制备与核糖体RNA耗竭，在MiSeq或iSeq 100平台（Illumina）上进行双端150 bp测序。生物信息学分析在Migale集群上完成，利用Fastp进行质量控制，SPAdes进行从头组装，VirHunter深度学习模型进行病毒序列筛选，Diamond进行蛋白质分类学注释，Bowtie 2进行序列比对，并通过ERCC（External RNA Controls Consortium）外参RNA进行质量控制。
研究结果部分：
一、测序数据质量分析。各样本原始读段数介于130万至490万之间，中位数为240万。过滤后Q30及以上碱基比例达94.5%-98.9%，表明测序数据质量良好。
二、对照分析。阴性对照中ERCC片段检出均值为43.2±2.68，所有测序运行均高于阈值35。阴性对照分析显示仅检出极低水平病毒读段，最高为GH1-4中ToBRFV基因组的8.1%覆盖度，低于阳性判定阈值，未检出其他病毒或类病毒，表明交叉污染控制良好。
三、混合样本制备前各组分状态验证。单独测序确认样本20/13,4含ToBRFV（平均读段深度MRD>38,000）、22/4243含ToLCNDV（DNA-A的MRD为260）、12/456i22含PCFVd。样本22/4243中还意外检出西瓜花叶病毒、摩洛哥西瓜花叶病毒及葫芦蚜传黄化病毒，样本12/456i22中检出烟草脉带病毒，但这些意外发现不影响验证进行。
四、分析灵敏度评估。采用未稀释、10
-2、10
-4及10
-6四个浓度梯度的混合样本进行三重复独立实验（提取、建库、测序均独立）。ToBRFV灵敏度最佳，在10
-2稀释度（考虑原始样本在混合液中的稀释，相当于原始样本稀释2.2×10
-4）的三个重复中均被检出。ToLCNDV和PCFVd在10
-2稀释度可重复检出，但ToLCNDV一个重复需经专家解读判定为阳性（覆盖度89.7%，CCB 24.4%）。
五、选择性评估。将混合样本分别与提取困难的葡萄属（Vitis sp.）和大戟属（Euphorbia sp.）植物材料混合。葡萄属样本RNA浓度228 ng/μL、RIN 5.9；大戟属样本198 ng/μL、RIN 6.1。过滤后读段数分别为170万和330万。与纯混合样本相比，葡萄属中PCFVd和ToBRFV的MRD分别下降超过10倍和100倍以上，大戟属中下降趋势较轻。两种基质中覆盖度均保持80%以上，仅葡萄属中ToBRFV的CCB低于自动判定阈值。
六、分析特异性评估。对含近缘种的11个样本进行分析，包括2个含与ToBRFV近缘的烟草花叶病毒和烟草轻型绿花叶病毒的样本、含不同Begomovirus的样本以及含其他类病毒的样本。结果表明，各样本中均正确鉴定了实际存在的病毒，ToBRFV、ToLCNDV和PCFVd检测结果均为阴性。样本EL 20 30031中，用于比对的番茄双生病毒Senegal序列与番茄曲叶马里病毒全基因组有98.3%的一致性。样本17/104,1中三个重叠群分别对应辣椒曲叶病毒和辣椒曲叶病毒，需进一步分析区分。PCR和Sanger测序确认结果与HTS预期一致。
七、重复性与再现性评估。重复性基于灵敏度分析中的三重复数据，自动判定结果的重复性为94.4%，MRD、覆盖度和CCB的相对标准偏差分别为8%-69%、0%-28%和0%-80%。再现性通过两个维度验证：不同操作员处理样本NPPO-NL 4972392（低RIN盲样），以及不同测序仪（MiSeq与iSeq 100）测序D2稀释度文库。操作员间检测结果一致，MRD占总读段比例相同，覆盖度和CCB均接近100%。测序仪间MRD和覆盖度比值介于0.75-1，iSeq 100的CCB值较高（ToBRFV和PCFVd比值分别为1.8和1.9）。
讨论与结论部分，研究人员指出HTS已成为无先验分子检测方法的新金标准，但技术选择与资源配置显著影响检测性能。本研究选择核糖体耗竭总RNA测序策略，基于文献依据及实验室经验，核糖体耗竭可实现病毒RNA高达10倍的富集。实验采用的健康对照样本加入ERCC外参RNA进行质控，设定了35/92片段的检出阈值，有效监控了实验稳定性。
验证过程中，ToBRFV因植物体内滴度高而表现出最高灵敏度，这也反映了文库制备策略的影响：小RNA测序对ssDNA病毒和类病毒回收更好，而核糖体耗竭总RNA更有利于线性RNA基因组。研究同时证实，即使测序深度低于100万读段，仍可有效检测三种靶标及进行有症状植物样本诊断，灵敏度更多取决于基因组大小、病毒类型及背景核酸量。
生物信息学分析中，VirHunter卷积神经网络（CNN）虽非完美，但有效辅助了病毒序列筛选和自动化比对。研究建立了基于覆盖度（>33%）和CCB（最大连续覆盖碱基百分比）的判定阈值，CCB尤其有助于区分病毒与其近缘种。如样本19/70中，番茄花叶病毒污染导致ToBRFV比对覆盖度50.6%但CCB仅9.56%，据此可明确归属。
研究人员承认，由于成本限制，验证未完全遵循传统技术的样本量建议，但现有验证已满足方法预期用途。最终结论指出，该方法适用于常规诊断工具无法检出病原、但症状或显微观察提示病毒学病因的样本检测，现已投入实际应用。
