利用TXRF分析和基于反应的血浆光学指纹技术检测小鼠体内的恶性肿瘤

《Analytica Chimica Acta》：Detection of malignancies in mice using TXRF analysis and reaction-based optical fingerprinting of blood plasma

　　

亚历山大·O·乌斯秋扎宁（Alexander O. Ustyuzhanin）|叶夫根尼·V·斯科罗博加托夫（Evgenii V. Skorobogatov）|古拉莱克·巴巴耶娃（Gulalek Babayeva）|瓦迪姆·S·波克罗夫斯基（Vadim S. Pokrovsky）|伊琳娜·A·索洛沃娃（Irina A. Solovova）|塔季扬娜·A·波德鲁吉娜（Tatyana A. Podrugina）|达莉亚·G·菲拉托娃（Daria G. Filatova）|米哈伊尔·K·贝克列米舍夫（Mikhail K. Beklemishev）

俄罗斯莫斯科洛莫诺索夫国立大学化学系

摘要

本研究探讨了基于反应的光学指纹识别技术和总X射线荧光（TXRF）元素分析方法的潜力，这两种方法既可以单独使用，也可以结合使用，作为一种快速且经济高效的癌症初步诊断手段。实验分析了移植了乳腺癌（EMT-6）的BALB/c小鼠以及移植了刘易斯肺癌（LLC）或B16黑色素瘤的BDF1小鼠的血浆样本。光学指纹识别技术利用了在血浆存在下碳氰化物染料氧化速率的差异。通过摄影记录了荧光和吸收强度的变化，从而实现了高通量分析。获取的图像被数字化后，使用多种统计方法对数据进行了处理。在有限的概念验证数据集中，基于反应的光学指纹识别技术在多个分类任务中达到了100%的准确率，能够区分接种肿瘤细胞后不同时间点的健康动物和患病动物：LLC为1周，B16为2周，EMT-6为3周。同时使用TXRF技术对相同样本进行了分析，也在区分健康动物和患有LLC（1周和2周后）或B16黑色素瘤（2周后）的小鼠时达到了100%的识别准确率。尽管将基于反应的光学指纹识别数据和TXRF分析数据直接结合并未显著提高识别准确性，但两种方法相互补充，能够有效筛查多种类型的癌症。总体而言，基于动力学的光学指纹识别方法在区分小鼠不同类型和阶段的恶性肿瘤方面显示出巨大潜力。

引言

早期癌症诊断是医学领域最紧迫的问题之一。目前，通常使用计算机断层扫描（CT）、磁共振成像（MRI）、组织活检及其病理形态学分析、细胞学检查和内镜组织检查来实现这一目标¹。然而，MRI和CT在早期检测癌症时往往缺乏足够的灵敏度。内镜检查更为准确，但仅适用于某些类型的癌症²。组织学和细胞学分析高度依赖于操作者。已经开发出多种用于筛查各种类型癌症的测试系统。能够同时检测多种癌症类型的多检测平台取得了显著进展。恶性细胞具有独特的表观遗传特征，这促使了诸如Galleri（GRAIL）等平台的开发，该平台利用高通量测序（NGS）来确定循环肿瘤DNA（ctDNA）中CpG岛的甲基化情况。机器学习方法用于分析这些模式以检测癌症并预测其位置。Galleri测试已证明³能够检测超过50种类型的癌症，尽管对早期阶段（I-II期）的灵敏度仍然较低（分别为16%和40%）。CancerSEEK测试基于类似原理，最初结合了多个基因的突变分析和蛋白质标志物水平⁴。尽管基于ctDNA的方法已得到广泛应用，但其他用于癌症检测的筛查平台也在积极探索中。例如，一种高灵敏度的化学发光免疫测定（CLIA）平台能够同时测量62种血清生物标志物，包括传统肿瘤标志物、炎症蛋白和代谢指标，显示出高特异性（约90%）和灵敏度⁵。这些特定筛查方法的一个显著缺点是成本高昂且需要复杂的分析设备。非特异性筛查方法的发展对于癌症的早期诊断具有前景。这些方法应能检测出隐藏的病理情况，并在结果呈阳性时将患者转诊进行进一步诊断。血浆或血清、唾液和尿液等生物流体适合作为检测样本。此类诊断测试可以使用简单且经济的光学技术进行。

指纹识别方法允许比较和分类成分相似的样本；光学传感器系统依赖于光谱信息，这些信息取决于样本化学成分的细微差异。过去几十年中，指纹识别策略已被用于食品工业、医疗保健、环境保护等多个领域的复杂样本分类。与传统识别方法相比，指纹识别方法具有多个优势：无需样本预处理、分析速度快、能够通过检测血浆成分的微妙变化实现早期诊断、可以使用单一传感系统诊断多种疾病、相对简单且分析成本低⁶。

迄今为止，文献中提出了多种利用指纹识别方法识别肿瘤病理的方法，这些方法基于光谱数据：红外光谱法、荧光法、表面增强拉曼散射和“电子鼻”系统。表1展示了各种方法的性能信息。

关于癌症血清的光学指纹识别在文献中的研究较少¹⁹，尽管它可能是最简单、最方便、最快、最便携且最具成本效益的方法之一。我们开发了一种基于在复杂成分样本存在下进行指示反应的动力学指纹识别方法。我们使用化学计量技术区分了来自不同来源的样本：天然水²⁰、辐照食品²¹等，准确率高达100%。这些研究中的有希望的结果促使我们将这种方法扩展到更复杂的基质（如血浆），以开发癌症筛查诊断方法。

本研究的目的是探讨使用基于指示反应的策略对小鼠体内移植肿瘤进行荧光和比色检测的可行性。我们评估了两种技术的效率：碳氰化物染料氧化指示反应和总X射线荧光（TXRF）技术，用于区分携带肿瘤的不同品系的小鼠及其肿瘤进展的不同阶段，并探讨了将动力学方法与TXRF结合的潜力。

章节摘录

化合物

碳氰化物染料的结构如图1所示。染料1由作者合成²²，染料2（Cy7肼）购自Lumiprobe Corporation（https://www.lumiprobe.com）。这些染料在1 g/L的乙醇（95%，Bryntsalov-A，莫斯科，俄罗斯）中溶解，并在使用当天用乙醇（染料2）或水（染料1）稀释10倍。使用的磷酸盐缓冲液浓度为0.067 M（按磷酸根离子计），pH值分别为4.8和7.4。H₂O₂（特殊纯度），NaOCl（2 M溶液，Aquatics，

基于反应的光学指纹识别方法原理

基于反应的光学指纹识别是一种利用荧光团氧化的非特异性指示反应的方法，这些反应在待识别样本的存在下进行。分析在荧光板上进行（图2）。在大约60分钟的时间内，定期记录可见光区域的荧光强度和吸收变化。记录下来的照片被数字化后，提取RGB通道，随后

讨论

研究表明，基于反应的光学指纹识别和TXRF元素分析作为非特异性癌症检测方法具有显著潜力。实验表明，动力学指纹识别可以区分健康小鼠和患有乳腺癌或刘易斯肺癌的小鼠的血浆样本。然而，尽管能够区分健康和患病样本，但无法可靠地区分这两种类型的癌症

结论

研究表明，使用非特异性指纹识别方法（基于反应的光学指纹识别和X射线荧光分析）在临床前模型中进行癌症初步诊断是可行的，但当前的工作应被视为概念验证研究。在某些任务中观察到的高识别准确率需要在更大规模的独立样本中得到验证，因为特别是在LLC和B16组中，生物样本的数量有限

CRediT作者贡献声明

亚历山大·O·乌斯秋扎宁：研究、数据管理。叶夫根尼·V·斯科罗博加托夫：撰写——初稿、可视化、软件、方法学、数据管理。古拉莱克·巴巴耶娃：撰写——审阅与编辑、资源、方法学。米哈伊尔·K·贝克列米舍夫：撰写——审阅与编辑、监督、方法学、概念化。瓦迪姆·S·波克罗夫斯基：撰写——审阅与编辑、资源。伊琳娜·A·索洛沃娃：资源。塔季扬娜·A·波德鲁吉娜：资源、方法学。达莉亚·G·菲拉托娃：方法学、数据

伦理批准

所有涉及动物的研究程序均符合俄罗斯卫生部N.N. Blokhin国家肿瘤医学研究中心伦理委员会批准的伦理标准（2025年6月17日协议编号2025-3g）。

资助

生物实验得到了俄罗斯联邦卫生部的国家计划（NUYO-2026-0047的支持，化学工作由洛莫诺索夫莫斯科国立大学资助，合同编号为AAAA-A21-121011990021-7。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢Ekaterina V. Moiseeva在术语使用方面提供的建议。