6PPD醌通过氧化应激诱导鱼类细胞产生细胞因子

《Aquatic Toxicology》：6PPD quinone induces cytokine production in fish cells via oxidative stress

　　

N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基对苯二胺（6PPD）作为轮胎制造中的添加剂被广泛使用。6PPD醌（6PPDQ）是6PPD在环境中形成的一种衍生物，对鲑科鱼类具有毒性，尤其对银鲑（Oncorhynchus kisutch）毒性显著。不同鱼类物种在细胞水平上对6PPDQ的敏感性存在差异。本研究比较了6PPDQ对3种鲑科鱼类细胞系的影响：银鲑（CSE-119细胞）、虹鳟（RTG-2细胞）和帝王鲑（CHSE-214细胞）。研究人员还考察了7PPD和8PPD及其醌衍生物，这些化合物是6PPD的结构类似物。6PPDQ在CSE-119细胞中引起显著的代谢抑制、线粒体抑制以及细胞膜损伤。6PPDQ处理在RTG-2细胞中也表现出细胞毒性，但作用弱于CSE-119细胞。相比之下，6PPDQ对CHSE-214细胞的影响极小。6PPD和6PPDQ降低了CSE-119细胞的线粒体膜电位，并增加了氧化应激。相反，RTG-2和CHSE-214细胞的线粒体膜电位升高。此外，6PPDQ上调了CSE-119和RTG-2细胞中编码白细胞介素（IL）-8和IL-1β的基因表达。6PPDQ还促进了RTG-2细胞中编码血红素加氧酶-1（HO-1）的基因表达，HO-1是一种氧化应激反应蛋白。6PPDQ在CSE-119和RTG-2细胞中诱导线粒体功能障碍、氧化应激和细胞因子基因表达。相比之下，CHSE-214细胞对氧化应激表现出较高耐受性。这种耐受性很可能在6PPDQ物种特异性反应中发挥关键作用。此外，7PPDQ和8PPDQ在CSE-119和RTG-2细胞中的细胞毒性低于6PPDQ，提示碳原子数可能是决定6PPDQ细胞毒性的重要因素。本研究为降低6PPDQ作为轮胎添加剂对鱼类的毒性及其环境影响提供了有价值的数据。

该论文发表于《Aquatic Toxicology》，围绕轮胎抗降解剂衍生污染物6PPD醌（6PPDQ）对鱼类细胞的毒性机制展开。6PPD是轮胎工业中广泛应用的胺类抗氧化剂，在环境中可经臭氧氧化转化为6PPDQ。近年来，6PPDQ因被证实与银鲑在城市河流回游繁殖过程中的急性死亡密切相关，而成为新兴环境污染物研究热点。已有研究表明，不同鲑科鱼类乃至不同来源的鱼类细胞对6PPDQ的敏感性存在显著差异，但这种差异究竟由何种细胞学机制驱动，仍不清楚。尤其是，线粒体损伤、活性氧（ROS，reactive oxygen species）积累、氧化应激以及炎症相关细胞因子诱导之间的联系，尚缺乏系统性的鲑科鱼类细胞证据。因此，开展本项研究的必要性在于，从细胞机制层面阐明6PPDQ的毒性通路，并解释其在不同鱼类细胞中的差异性反应，从而为水生生态风险评估及更安全轮胎添加剂的开发提供依据。

研究人员选取了3种鲑科鱼类来源的细胞系，即来源于银鲑胚胎的CSE-119细胞、来源于虹鳟性腺组织的RTG-2细胞以及来源于帝王鲑胚胎的CHSE-214细胞，对6PPD、6PPDQ及其结构类似物7PPD、8PPD及相应醌衍生物进行了比较研究。结果表明，6PPDQ的细胞毒性显著强于6PPD，且不同细胞系之间差异明显：CSE-119最敏感，RTG-2次之，CHSE-214则表现出较强耐受性。进一步研究显示，6PPDQ可在敏感细胞中诱导线粒体功能障碍、升高细胞内ROS水平，并促进IL-8与IL-1β等炎症相关基因表达；而对氧化应激耐受较高的CHSE-214细胞，上述效应较弱。研究还发现，7PPDQ与8PPDQ的毒性低于6PPDQ，提示侧链碳数可能影响其细胞毒性。整体而言，该研究的重要意义在于提出：氧化应激耐受能力可能是决定鲑科鱼类细胞对6PPDQ敏感性差异的关键因素，并为理解轮胎来源污染物的结构—毒性关系提供了实验依据。

本研究主要采用了几类关键技术方法。首先，以3种鲑科鱼类细胞系作为体外模型，其中CSE-119来源于银鲑胚胎、RTG-2来源于虹鳟性腺组织、CHSE-214来源于帝王鲑胚胎。其次，通过alamarBlue法检测细胞代谢活性、MTT法评估线粒体活性、乳酸脱氢酶（LDH，lactate dehydrogenase）释放法评估细胞膜损伤。再次，采用DCFH-DA荧光探针检测细胞内ROS水平，应用JC-1法测定线粒体膜电位。最后，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）检测HMOX1、IL-8及IL-1β等基因表达，以分析氧化应激与炎症反应相关分子变化。

在“3.1. Effects of 6PPD and 6PPDQ on Cell Viability”部分，研究人员通过alamarBlue法检测细胞代谢活性，结果显示6PPDQ显著降低CSE-119和RTG-2细胞活力，而对CHSE-214几乎无明显影响。其中CSE-119最为敏感，在极低浓度下即出现显著活力下降；6PPD本身仅在最高浓度下对CSE-119产生轻微影响。MTT结果与之基本一致，说明6PPDQ对敏感细胞的线粒体代谢具有明显抑制作用。

在“3.2. Effects of 6PPD and 6PPDQ on Cell Membrane Damage”部分，研究人员通过LDH释放实验评价细胞膜损伤。结果显示，6PPD处理后各细胞系均未见明显膜损伤，而6PPDQ则诱导浓度依赖性的细胞膜损伤。CSE-119和RTG-2细胞在较低至中高浓度下均出现显著LDH释放，CHSE-214仅在较高浓度下出现较弱效应。这说明6PPDQ不仅抑制代谢和线粒体功能，而且可进一步破坏膜完整性并导致细胞死亡。

在“3.3. Effects of 6PPD and 6PPDQ on Oxidative Stress”部分，研究人员检测细胞内ROS和HMOX1表达。结果表明，6PPDQ显著提高CSE-119与RTG-2细胞中的ROS水平，且CSE-119升幅更大；CHSE-214中ROS变化很小。HMOX1方面，6PPDQ在RTG-2细胞中显著诱导其表达，但在CSE-119和CHSE-214中无明显上调。这提示不同细胞对氧化应激的应答方式存在差异：RTG-2可能仍具有一定抗氧化应答能力，而CSE-119可能已处于更严重的应激损伤状态。

在“3.4. Effects of 6PPD and 6PPDQ on Mitochondrial Membrane Potential”部分，JC-1检测显示，6PPD和6PPDQ均可降低CSE-119细胞的线粒体膜电位，提示线粒体去极化（depolarization）和功能障碍。相对地，在RTG-2和CHSE-214细胞中，这两种化合物反而使线粒体膜电位轻度升高，表现为超极化（hyperpolarization）样变化。与此同时，H₂O₂和AAPH均使3种细胞的线粒体膜电位下降。该结果表明，不同细胞对6PPDQ的线粒体应答模式并不相同，可能反映了不同阶段或不同类型的应激反应。

在“3.5. Effects of 6PPD and 6PPDQ on Cytokine Gene Expression”部分，研究人员发现6PPDQ明显诱导CSE-119细胞中IL-8和IL-1β基因表达，其中IL-1β升高尤为显著；在RTG-2细胞中，两者也被诱导上调，但强度弱于CSE-119，且未显示清晰的浓度依赖性；在CHSE-214细胞中，6PPD和6PPDQ均未明显影响这两种细胞因子基因表达。该结果支持6PPDQ可在敏感细胞中触发炎症相关分子反应，并且这种诱导与细胞敏感性相一致。

在“3.6. Oxidative Stress Response in Fish Cells”部分，研究人员进一步使用过氧化氢（H₂O₂）和自由基引发剂AAPH模拟氧化应激，以比较不同细胞的应答能力。alamarBlue结果显示，3种细胞在总体代谢活力上的差异不如6PPDQ处理时明显；但MTT结果显示CSE-119对氧化应激更敏感。基因表达方面，HMOX1、IL-8和IL-1β在CSE-119和RTG-2中普遍可被H₂O₂和AAPH诱导，而CHSE-214反应较弱，尤其IL-8几乎不受影响。这表明6PPDQ诱导的细胞因子表达，很可能与其引起的氧化应激和线粒体损伤密切相关；CHSE-214对氧化应激的较高耐受性，可能解释其对6PPDQ低敏感性。

在“3.7. Cellular Effects of 7PPD, 8PPD, and their Quinone Derivatives”部分，研究人员比较了6PPD类似物的细胞效应。结果显示，7PPDQ和8PPDQ在3种细胞中的细胞毒性均低于6PPDQ。无论是alamarBlue还是MTT检测，7PPDQ和8PPDQ对CSE-119与RTG-2的抑制作用都明显较弱，对CHSE-214几乎无影响。基因表达分析进一步显示，在CSE-119中，7PPDQ和8PPDQ仅轻度诱导HO-1、IL-8和IL-1β，而在RTG-2和CHSE-214中几乎无明显作用。这说明PPD类化合物侧链长度相关的结构差异，可能影响其对鱼类细胞的毒性强度。

讨论部分指出，本研究从多个层面证明，6PPDQ较6PPD具有更强的鱼类细胞毒性，并且这种毒性具有显著的细胞类型差异。CSE-119和RTG-2作为相对敏感的细胞，表现出代谢抑制、线粒体损伤、ROS升高及炎症细胞因子表达增强等一系列连续变化，而CHSE-214则表现出较强耐受性。研究结果支持这样一种机制框架：6PPDQ首先损害线粒体功能，继而诱发ROS积累和氧化应激，进一步上调IL-8与IL-1β等炎症相关基因，最终导致细胞损伤甚至死亡。研究还指出，这种敏感性差异不仅可能与物种有关，也可能与细胞来源组织和细胞表型有关。与此同时，7PPDQ和8PPDQ毒性更低的结果，提示碳链长度可能是影响PPD醌类化合物鱼类细胞毒性的结构决定因素。作者同时强调，本研究未直接测定暴露体系中的实际溶解浓度及转化产物，这构成结果解释的重要限制。

研究结论部分可概括为：6PPDQ可在银鲑来源CSE-119细胞和虹鳟来源RTG-2细胞中诱导线粒体功能障碍、氧化应激以及细胞因子基因表达，而帝王鲑来源CHSE-214细胞对氧化应激具有较高耐受性，这种耐受性可能是其对6PPDQ低敏感性的关键基础。此外，7PPDQ和8PPDQ的细胞毒性低于6PPDQ，提示碳原子数可能是决定其细胞毒性的重要因素。本研究为降低6PPDQ对鱼类的毒性及减轻其环境影响提供了有价值的数据。